不同施肥條件下黃瓜連作土壤微生物多樣性分析.pdf

1、隨著我國(guó)設(shè)施農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，連作障礙越來越突出。黃瓜作為設(shè)施蔬菜主要品種之一，近年來其連作障礙的發(fā)生機(jī)制及其防治措施受到學(xué)者們較廣泛的關(guān)注，已有的研究表明，土壤微生物區(qū)系失衡是黃瓜連作障礙發(fā)生的主要原因之一，并且認(rèn)為施用有機(jī)肥及微生物肥料可以改善土壤理化性質(zhì)、調(diào)節(jié)土壤微生物生態(tài)，能有效解除作物連作障礙?；实倪^量及不適當(dāng)使用，也是導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)劣化，土壤微生物區(qū)系失衡的主要原因之一。因此通過有機(jī)肥、微生物肥以及化肥的合理施用，建立合理

2、的施肥策略，對(duì)于黃瓜種植產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。本文通過設(shè)置化肥(FT)、普通有機(jī)肥+化肥(FC)、生物有機(jī)肥+化肥(FB)以及不施肥(CK)等不同施肥處理，研究不同施肥條件下黃瓜連作過程中土壤微生物多樣性的動(dòng)態(tài)變化，分析連作土壤中假單胞菌、hcnAB、phzF、黃瓜枯萎病原菌豐度的變化，并借助Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)，了解不同施肥措施對(duì)連作黃瓜土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為黃瓜連作生產(chǎn)中健康土壤微生物區(qū)系的維持以及連作障

3、礙的預(yù)防及緩解提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)利用稀釋平板計(jì)數(shù)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)等方法，分析了不同施肥處理?xiàng)l件下連作7茬黃瓜土壤細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量及多樣性的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明:隨著連作茬數(shù)的增加，根際土壤微生物數(shù)量呈逐漸增加趨勢(shì);與對(duì)照相比，F(xiàn)T處理總體上明顯促進(jìn)了連作土壤中放線菌、真菌數(shù)量的增加，而對(duì)細(xì)菌數(shù)量的增加有明顯抑制作用;有機(jī)肥施用對(duì)細(xì)菌、放線菌數(shù)量的增加均有不同程度的促進(jìn)作用，除生物

4、肥連作后期（5茬后）對(duì)真菌數(shù)量的增加有促進(jìn)作用外，有機(jī)肥施用總體上抑制了土壤真菌數(shù)量增加。連作及不同施肥方式對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生不同程度影響，除對(duì)照外，各施肥處理土壤細(xì)菌多樣性以及豐富度隨著連作茬數(shù)的增加均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，相對(duì)于FT及FC處理，F(xiàn)B處理對(duì)于維持連作過程細(xì)菌多樣性及豐度具有明顯的積極意義;各施肥處理土壤真菌多樣性以及豐富度隨著連作茬數(shù)的增加均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但與不施肥處理相比上升幅度較小，且連作7茬后土壤真菌多樣性及豐富度

5、表現(xiàn)為FB＞FC＞FT。
　　(2)采用RT-PCR和PCR-DGGE方法，對(duì)第1茬及第8茬黃瓜連作土壤假單胞菌豐度及多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明:與CK相比，各種肥料施用對(duì)第1茬黃瓜根際土壤假單胞菌豐度的增加均有明顯促進(jìn)作用，連作8茬后FT處理明顯降低了假單胞菌豐度，而有機(jī)肥處理對(duì)豐度的影響不明顯;與第1茬相比，各施肥處理連作8茬后土壤假單胞菌豐度及相對(duì)豐度均明顯下降。連作使土壤假單胞菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性及豐富度有一定程度的增加，并

6、且第1茬不同施肥處理間差異較大，而連作8茬后差異度明顯下降，在維持黃瓜連作過程土壤假單胞菌多樣性及豐富度的能力上FB＞FT＞FC;對(duì)假單胞菌DGGE條帶測(cè)序比對(duì)可知，連作使各施肥處理Pseudomonas fluorescens、Pseudomonasputida、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas sp.等有益菌豐度均有增加;FB處理對(duì)Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas

7、 putida、Pseudomonas stutzer、Pseudomonasalcaligenes、Pseudomonas sp.等有益菌豐度增加均有促進(jìn)作用，而FC處理Pseudomonasalcaligenes豐度有所下降。連作增加了對(duì)黃瓜土傳病害具有拮抗作用假單胞菌有益菌群的豐度，生物有機(jī)肥的施用能夠促進(jìn)有益菌群豐度的增加。
　　(3)利用RT-PCR方法，分析不同施肥條件下黃瓜連作土壤與土傳病發(fā)生相關(guān)的尖孢鐮刀菌(MAT

8、)、黃瓜枯萎病原菌(OPZ)的豐度以及與土傳病原真菌控制相關(guān)的hcnAB、phzF等功能基因豐度的變化。結(jié)果表明:連作導(dǎo)致土傳病發(fā)生相關(guān)基因相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，這種趨勢(shì)在普通有機(jī)肥處理中更為明顯，而化肥、生物有機(jī)肥處理對(duì)這種趨勢(shì)具有抑制或緩解作用;連作導(dǎo)致可能對(duì)土傳病菌具有抑制作用的假單胞菌的相對(duì)豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這種趨勢(shì)在化肥、生物有機(jī)肥處理中更為明顯，而普通有機(jī)肥處理對(duì)這種趨勢(shì)具有抑制或緩解作用;此外，土傳病發(fā)生相關(guān)基因相對(duì)豐度與可

9、能對(duì)土傳病菌具有抑制作用的假單胞菌的相對(duì)豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　(4)應(yīng)用Illumina Miseq平臺(tái)，對(duì)CK、FT、FC、FB以及FCB(化肥+普通有機(jī)肥+微生物有機(jī)肥)等施肥處理連作8茬土壤真菌IST1區(qū)進(jìn)行了高通量測(cè)序，共計(jì)獲得了2，696，679條有效序列及2，036，675條優(yōu)質(zhì)序列。
　　Alpha多樣性分析結(jié)果表明:與CK相比，F(xiàn)C、FT處理對(duì)非根土壤真菌豐富度提高有促進(jìn)作用;FT、FB、FC及FCB處理均不

10、同程度地降低了根際土壤真菌多樣性及豐富度，該結(jié)果與前述第7茬黃瓜連作土壤真菌PCR-DGGE分析結(jié)果一致。
　　比較不同肥料處理土壤真菌主要門相對(duì)豐度可知:與CK相比，化肥、有機(jī)肥的施用總體上均降低了土壤Ascomycota、Glomeromycota、Zygomycota相對(duì)豐度，其中FC處理下降幅度最大;化肥、有機(jī)肥的施用均增加了根際土Basidiomycota相對(duì)豐度，但在非根際土中，除了FB處理，其余處理均顯著降低了Bas

11、idiomycota相對(duì)豐度;除了FCB處理，其余處理Chytridiomycota相對(duì)豐度均有不同程度的增加，其中FT處理增加幅度最大。
　　土壤中最豐富的前20種OTUs統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:豐度排在最前的4個(gè)種類分別為Fusarium solani、Fusarium oxysporum、Acremonium sp.、Mortierella alpina，而根際土壤中豐度排在最前的4個(gè)種類分別為Fusarium solani、Asco

12、mycota sp.、Fusarium oxysporum及Acremonium sp.。對(duì)土壤20個(gè)最豐富物種中的土傳病原真菌及作物生長(zhǎng)有益菌相對(duì)豐度進(jìn)行施肥處理間差異顯著性分析，結(jié)果表明:相對(duì)于CK及FT處理，不同有機(jī)肥處理對(duì)根際、非根際土壤不同土傳病原真菌豐度具有不同程度的控制作用，同時(shí)，不同施肥處理土壤有益真菌豐度也有不同程度的下降。
　　Beta多樣性分析結(jié)果表明，無論根際土還是非根際土，化肥處理與不施肥處理群落結(jié)構(gòu)差異

13、較小，F(xiàn)B、FC及FCB等3種有機(jī)肥處理群落結(jié)構(gòu)與CK差異均較大，并且生物有機(jī)肥與普通有機(jī)肥處理間群落結(jié)構(gòu)均有較大的分異度。通過主成分分析(PCA)以及屬分類水平上的聚類分析均獲得相似結(jié)果。
　　RDA分析結(jié)果表明:不同施肥處理導(dǎo)致土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的明顯分化，與多種土壤理化因子密切相關(guān)，其中，pH以及氨態(tài)氮含量與CK及FT處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的形成關(guān)系密切，而全氮、速效磷、速效鉀、有機(jī)碳、全磷、硝態(tài)氮等理化因子共同影響FC、FB及