AtICE1等多價外源基因表達對番茄耐寒性影響.pdf

1、番茄（Solanum lycopersicum L.）不僅是一種重要的蔬菜，而且也是一種重要的模式植物。在我國種植番茄已經(jīng)成為部分農(nóng)民的主要經(jīng)濟來源，在經(jīng)濟和農(nóng)村社會發(fā)展中發(fā)揮著越來越重要的作用。番茄是冷敏感植株，周期性的寒害給我國番茄產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，培育耐寒品種是解決番茄寒害的重要途徑。傳統(tǒng)的育種方法存在著生產(chǎn)周期長、工作量大、資源匱乏等缺點，因此難以通過傳統(tǒng)的育種方式培育耐寒品種，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)為培育耐寒品種提供了很好的途徑。

2、轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的耐寒材料有著試驗周期短和低成本等優(yōu)點，但植物的耐寒性是由多個微效基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，轉(zhuǎn)入1-2個耐寒性基因并不能顯著提高植物的耐寒性，具有一定的局限性。因此，本研究將多價基因?qū)敕眩苑治鲛D(zhuǎn)基因番茄植株的耐寒性。主要的研究結(jié)果如下：
　　1．整合有AtCBF1等四價轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄各12株，置于4℃低溫處理7天后，隨之2℃低溫處理14天，觀察冷害癥狀。4℃低溫處理7天，野生型番茄萎焉，番茄頂端甚至出現(xiàn)嚴

3、重脫水癥狀，四價轉(zhuǎn)基因番茄葉片稍微卷曲，表現(xiàn)出比野生型植株有更強的耐寒性，在此期間，二者均沒有冷害致死；2℃處理14天時，野生型番茄已經(jīng)冷害致死，四價轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片出現(xiàn)嚴重脫水癥狀并且頂端倒伏但沒冷害致死，表現(xiàn)出比野生型植株有更強的耐寒性。最后，將這些番茄植株在25℃光照培養(yǎng)箱進行恢復(fù)處理，在恢復(fù)7天后，野生型番茄依然死亡，而四價轉(zhuǎn)基因番茄萎焉枝葉恢復(fù)正常，在恢復(fù)14天時，四價轉(zhuǎn)基因番茄的長出新葉。這些結(jié)果顯示四價外源基因的表達增強

4、了番茄的耐寒性。
　　2．利用qRT-PCR對四價外源基因和番茄內(nèi)源基因的表達量進行測定，結(jié)果驗證了四價外源基因在轉(zhuǎn)基因番茄中均獲得表達，而且在6h表達量達到最高，其中AtCBF1-2提高了約12倍；AtCBF3提高了約30倍；AtICE1提高了約2倍，番茄內(nèi)源基因SlCi7、SlCi7、SlDEHL和SlCAT1相對表達量也在6h達到最高，提高了約10倍。
　　3．在4℃低溫下處理5天，對四價轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄進行耐寒

5、性相關(guān)的生理生化指標(biāo)測定。結(jié)果顯示，四價轉(zhuǎn)基因番茄的相對離子泄漏、丙二醛含量均要低于野生型番茄；而四價轉(zhuǎn)基因番茄的脯氨酸含量和抗氧化酶（CAT、POD和SOD）活性均高于野生型番茄。
　　4．經(jīng)PCR擴增檢測，在獲得的AtHOS10等十一價轉(zhuǎn)基因番茄（T2代）中檢測到3個純合株系。
　　5．整合有AtHOS10等十一價轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄各12株置于4℃低溫處理7天后，隨之2℃低溫處理14天，觀察冷害癥狀。4℃低溫處理7天

6、，野生型番茄嚴重倒伏并出現(xiàn)脫水癥狀，而十一價轉(zhuǎn)基因番茄葉片稍微卷曲，表現(xiàn)出比野生型植株有更強的耐寒性，在此期間，二者均沒有冷害致死。隨之，將這些植株進行2℃低溫處理，2℃處理14天時，十一價轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片出現(xiàn)嚴重脫水癥狀并且頂端倒伏但沒冷害致死，表現(xiàn)出比野生型植株有更強的耐寒性。最后，將這些番茄植株在25℃光照培養(yǎng)箱進行恢復(fù)處理，在恢復(fù)7天后，野生型番茄依然死亡，而十一價轉(zhuǎn)基因番茄萎焉枝葉恢復(fù)正常，在恢復(fù)14天時，十一價轉(zhuǎn)基因番茄長

7、出新的枝條并正常生長這些結(jié)果顯示十一價外源基因的表達增強了番茄的耐寒性。
　　6．利用qRT-PCR對十一價外源基因和番茄內(nèi)源基因的表達量進行測定，結(jié)果驗證了十一價外源基因在轉(zhuǎn)基因番茄中均獲得表達，而且在6h表達量達到最高值，其中AtCBF1-3和AtCOR15A提高了約20倍；AtICE1提高了約10倍，AtCOR47、AtLTI45和AtRD29A提高了約5倍；AtCBR15B、AtHOS10和AtZAT12提高了約2倍，番茄

8、內(nèi)源基因SlCi7、SlCi7和SlDEHL相對表達量也在6h達到最高值，分別提高了約5、3和10倍。
　　7．在4℃低溫下處理5天，對十一價轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄進行耐寒性相關(guān)的生理生化指標(biāo)測定。結(jié)果顯示，十一價轉(zhuǎn)基因番茄的相對離子泄漏、丙二醛含量均要低于野生型番茄；而十一價轉(zhuǎn)基因番茄的脯氨酸含量和抗氧化酶（CAT、POD和SOD）活性均高于野生型番茄。
　　該研究為今后深入研究AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、A