雌激素受體介導的報告基因試驗方法的建立.pdf

1、雌激素受體報告基因試驗也稱雌激素受體轉錄激活試驗，是EPA推薦的用于環(huán)境雌激素篩選的in vitro方法之一。雌激素受體報告基因試驗是以受體介導理論為基礎，應用基因重組技術，將報告基因置于外源性激素反應元件(ERE)的調控之下，構建重組報告基因載體，應用基因轉染技術導入真核細胞內，通過檢測化學物作用下報告基因編碼的酶活性或蛋白表達的變化，間接反映內源性基因的表達情況。這種方法既可檢測化學物與受體的結合能力，又可檢測結合后引起的生物學效應

2、，而且能夠區(qū)分激動劑和拮抗劑，與受體結合試驗相比可提供更多的信息，因此成為環(huán)境雌激素篩選的有力工具。本研究構建了兩種不同ERα介導的報告基因試驗，并探討了它們對三種擬除蟲菊酯類農藥的雌激素活性的影響。 第一部分 目的：建立人ER0a和大鼠ERa介導的報告基因試驗體系，并比較這兩種方法的反應性和靈敏度。 方法： 1.將表達人ER0a配體結合域和Ga14-BD(酵母轉錄因子結合域)融合蛋白的質粒pGa14-E

3、Radef與Ga14反應的報告基因質粒pUAS-tk-luc、對照質粒phRL-墩分別轉染CV-1細胞，轉染方式為瞬時轉染，建立ER介導的報告基因試驗。以E2為陽性對照檢測方法的篩選效率。 2.將表達大鼠ERa的質粒rERa/pCI與重組Luc報告基因質粒pERE-aug-Luc、對照質粒phRL-tk共轉染CV-1細胞，轉染方式為瞬時轉染，建立rERa介導的報告基因試驗。以雌二醇(E2)為陽性對照檢測方法的篩選效率。

4、結果： 1.在兩種ERa體系中，E2能明顯的誘導Luc的表達，并呈顯著的劑量-反應關系，10-7M達到最大值，最大誘導倍數(shù)分別為19.6和21.6倍，EC50為2.4 nM和0.9 nM。 2.用濃度從10-10M到10-8M的DES染毒hERa體系時，Luc的表達量與E2相似，且10μM的ICI182，780能完全阻斷這一效果。 結論： 1.本研究建立的兩種ERa報告基因試驗具有較高的靈敏度和重復性。E

5、2對Luc的誘導是ER依賴性的，并呈劑量-效應關系。表明該實驗系統(tǒng)能夠用來檢測擬雌激素活性的物質。 2.在hERα體系中，ICI182,780能有效抑制E2誘導的Luc的表達，表明hERa體系可以用來檢測化學物的抗雌激素活性。 3.兩種ERα對報告基因試驗E2的反應性無明顯區(qū)別，兩種體系的靈敏度也相似。 第二部分雌激素受體介導的報告基因試驗方法的應用 目的:應用兩種雌激素受體介導的報告基因試驗體系檢測三種擬除蟲菊

6、酯類農藥的擬或(抗)雌激素活性，并比較它們對這幾種化學物的反應性和靈敏度。 方法： 1.CV-1細胞轉染pUAS-tk-1uc、pGa14-ERadef和phRL-tk質粒后用三種擬除蟲菊酯類農藥(氰戊菊酯，氯氰菊酯，芐氯菊酯)染毒，根據(jù)該物質能否誘導LUC的表達，判斷化學物的ER激動作用。根據(jù)該物質能否拮抗E2誘導的Luc表達，判斷化學物的ER拮抗作用。 2.CV-1細胞轉染rERα/pCI、pERE-aug-

7、Luc和phRL-tk質粒后用三種擬除蟲菊酯類農藥染毒，根據(jù)該物質能否誘導Luc的表達，判斷化學物的ER激動作用。 結果： 1.三種擬除蟲菊酯類農藥在兩種體系中可以誘導Luc的表達，并呈顯著的劑量一反應關系，在10-4M達到最大值。 2.三種擬除蟲菊酯類農藥均無法抑制10-9M E2所誘導的Luc表達，結論1.所研究的三種擬除蟲菊酯類農藥都具有一定的擬雌激素活性，但活性強度均遠遠低于E2。 2.三種擬除蟲