嗜尸性麗蠅分子標(biāo)記的檢測(cè)及發(fā)育規(guī)律的研究.pdf

1、背景：
　　法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)在實(shí)踐中主要應(yīng)用于死亡時(shí)間(postmortem inteval，PMI)推斷。法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)推斷PMI的原理主要有兩種:一是研究尸體上主要嗜尸性昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律來(lái)推斷PMI;二是研究尸體上昆蟲(chóng)的種類(lèi)及演替規(guī)律來(lái)推斷PMI。即依據(jù)蠅類(lèi)的生活史、群落組成隨季節(jié)和時(shí)間的變動(dòng)規(guī)律來(lái)推斷PMI。中國(guó)幅員遼闊，不同地域昆蟲(chóng)的種類(lèi)及生活習(xí)性均不相同，不能簡(jiǎn)單地照搬其它地方的研究資料來(lái)進(jìn)行法醫(yī)實(shí)踐，但有必要借鑒前人的研究方法

2、來(lái)對(duì)各地區(qū)嗜尸性昆蟲(chóng)群落演替展開(kāi)調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)物種，并加以飼養(yǎng)，進(jìn)一步研究其生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，逐步建立適合于當(dāng)?shù)氐氖仁岳ハx(chóng)種類(lèi)的數(shù)據(jù)庫(kù)和推測(cè)系統(tǒng)，為法醫(yī)實(shí)踐提供依據(jù)。對(duì)嗜尸性昆蟲(chóng)，尤其是嗜尸性麗蠅進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的種類(lèi)鑒定，是PMI推斷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有著特別重要的作用。麗蠅往往是第一批到達(dá)尸體并產(chǎn)卵的嗜尸性昆蟲(chóng)，具有重要的法醫(yī)學(xué)意義，但一些近緣麗蠅物種和麗蠅幼蟲(chóng)之間的鑒別尚缺乏明顯的形態(tài)學(xué)特征。分子生物學(xué)物種鑒定技術(shù)，是形態(tài)學(xué)鑒定的

3、有力補(bǔ)充，此類(lèi)方法快捷、簡(jiǎn)便、有效。中國(guó)地理環(huán)境多樣，麗蠅種類(lèi)繁多，還需要積累更多的基因資源來(lái)進(jìn)行鑒定研究。因此有必要在全國(guó)范圍收集大量麗蠅樣本，并開(kāi)發(fā)新的嗜尸性麗蠅的分子標(biāo)記，完善嗜尸性麗蠅的鑒定系統(tǒng)。同時(shí)完善各種嗜尸性蠅類(lèi)的發(fā)育歷期、生長(zhǎng)曲線、及嗜尸性昆蟲(chóng)的演替等資料。但目前，國(guó)內(nèi)這些方面的資料還很缺乏。
　　目的：
　　1.在全國(guó)多個(gè)地區(qū)收集麗蠅樣本，對(duì)我國(guó)常見(jiàn)嗜尸性麗蠅的種類(lèi)、分布及嗜尸特性展開(kāi)調(diào)查，并在長(zhǎng)沙地區(qū)夏季

4、豬尸體上對(duì)常見(jiàn)嗜尸性昆蟲(chóng)群落種類(lèi)和演替規(guī)律進(jìn)行調(diào)查研究。
　　2.利用278bp COI線粒體基因片段和272bp COI片段對(duì)來(lái)自全國(guó)28個(gè)地區(qū)的130個(gè)麗蠅樣本進(jìn)行種類(lèi)鑒定，檢測(cè)這兩個(gè)基因片段對(duì)不同麗蠅物種的鑒別效力，構(gòu)建并完善我國(guó)嗜尸性麗蠅的分子標(biāo)記系統(tǒng)。
　　3.飼養(yǎng)優(yōu)勢(shì)嗜尸性蠅種，并研究其生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，為本地區(qū)法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.在全國(guó)不同經(jīng)緯度的28個(gè)地區(qū)，

5、用動(dòng)物尸體誘捕麗蠅并收集樣本。夏季在長(zhǎng)沙地區(qū)連續(xù)三年用豬尸體進(jìn)行演替實(shí)驗(yàn)。
　　2.用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，用勻漿法、蛋白酶K+酚/氯仿/異戊醇法提取足夠的基因組DNA，用Promega試劑盒擴(kuò)增PCR，用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA和PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化，產(chǎn)物批量送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Chromas及ClustalW等軟件閱讀、比對(duì)，截取等長(zhǎng)度片段。用Mega4.0進(jìn)行序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。將所獲得嗜尸

6、性麗蠅基因片段的數(shù)據(jù)上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　3.夏季在室內(nèi)自然條件下飼養(yǎng)絲光綠蠅、大頭金蠅和棕尾別麻蠅，測(cè)量它們的幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)和體重，還測(cè)量蠅蛹的長(zhǎng)、寬、重，并繪制它們隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線圖、構(gòu)建相關(guān)方程。
　　結(jié)果：
　　1.三年以來(lái)在全國(guó)范圍17個(gè)省28個(gè)地區(qū)收集了大量麗蠅樣本，初步形態(tài)學(xué)鑒定并選出13種130個(gè)麗蠅樣本。
　　2.連續(xù)三年夏季在長(zhǎng)沙地區(qū)野外及室內(nèi)用豬尸體進(jìn)行演替實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)嗜尸性昆蟲(chóng)29

7、種，分屬3目15科。
　　3.用278bp COI和272bp COI基因片段對(duì)來(lái)自全國(guó)多個(gè)地區(qū)的麗蠅進(jìn)行物種鑒定，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)片段均適合于嗜尸性麗蠅的物種鑒定，尤其是一些近緣種類(lèi)的鑒別。
　　4.用278bp COI片段進(jìn)行鑒定時(shí)，發(fā)現(xiàn)絲光綠蠅Lucilia sericata(Meigen，1826)和叉葉綠蠅Lucilia caesar(Linnaeus，1758)存在種內(nèi)基因地域差異。而272bp COI片段進(jìn)行鑒定時(shí)，

8、發(fā)現(xiàn)大頭金蠅Chrysomyamegacephala(Fabricius，1794)和新陸原伏蠅Protophormia terraenovae(Robineau-Desvoidy，1830)存在種內(nèi)基因地域差異。
　　5.成功地飼養(yǎng)了絲光綠蠅L.sericata、大頭金蠅C.megacephala和棕尾別麻蠅Boerttcherisca peregrine(Robineau-Desvordy，1830)。繪制了幼蟲(chóng)體長(zhǎng)、體重，蠅

9、蛹長(zhǎng)、寬、重隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線圖。發(fā)現(xiàn)幼蟲(chóng)體長(zhǎng)和時(shí)間的關(guān)系吻合三次方程L=aT3+bT2+cT+d，蠅蛹體重則符合一次方程W=aT+b。相關(guān)性顯著(R2＞0.9，P＜0.05)其中，L代表蛆長(zhǎng)，W代表蛹重，T代表時(shí)間，a、b、c、d為常數(shù)。
　　結(jié)論：
　　1.在我國(guó)多個(gè)地區(qū)進(jìn)行嗜尸性麗蠅樣本的采集，補(bǔ)充了嗜尸性麗蠅種類(lèi)及分布資料。
　　2.三年來(lái)在長(zhǎng)沙地區(qū)進(jìn)行了嗜尸性昆蟲(chóng)演替實(shí)驗(yàn)，對(duì)推斷PMI等法醫(yī)實(shí)踐具有一定的實(shí)

10、用價(jià)值。
　　3.短片段COI（278bp COI和272bp COI基因片段），具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效鑒別物種等優(yōu)點(diǎn)，適合基層法醫(yī)工作者應(yīng)用。
　　4.向GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上傳了13種麗蠅物種的145條COI基因片段，完善了數(shù)據(jù)庫(kù)并初步構(gòu)建了我國(guó)嗜尸性麗蠅分子標(biāo)記系統(tǒng)。
　　5.飼養(yǎng)一些有法醫(yī)學(xué)重要意義的嗜尸性蒼蠅并進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律研究，獲得了一些基礎(chǔ)性科學(xué)數(shù)據(jù)，為法醫(yī)實(shí)踐工作提供了理論依據(jù)，也為今后研究多種嗜