紅背葉根醇提物的藥效學(xué)及化學(xué)成分的初步研究.pdf

1、背景:
　　肝纖維化（Hepatic fibrosis）是指肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝臟中膠原蛋白等細胞外基質(zhì)(ECM)的增生與降解失去平衡，進而導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的病理過程。
　　紅背葉根為大戟科植物紅背山麻桿Alchornea trewioides(Benth.) Muell.-Arg.的根。分布于我國中部和東南、華南，通常以根、葉入藥。其根味甘，性平。功效清熱解毒，祛風(fēng)除濕，散瘀止血，平喘，殺蟲止癢。近

2、代醫(yī)學(xué)研究表明，紅背葉根中含大量生物堿和酚性物質(zhì)，具有止咳、祛痰作用，抗乙酰膽堿作用和輕度抑制金黃色與白色葡萄球菌作用。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其水提物及水提醇沉提取的浸膏具有抗肝炎病毒和抗肝纖維化的作用，可在臨床上用以治療慢性肝炎和肝硬化。課題組的研究結(jié)果表明紅背葉根可顯著抑制CCL4復(fù)合因素及酒精性肝纖維化大鼠血清中TGF-β1和TIMP-1，且能顯著降低血清中HA、PCⅢ、ALT、AST水平。臨床應(yīng)用試驗表明慢性乙型肝炎患

3、者給予紅背葉根20克，水煎服，每日一次。治療4周后，患者臨床癥狀均有一定的改善，尤其是緩解肝區(qū)不適感較明顯，患者肝功能均有不同程度改善;治療12周后，治療組與對照組比較，AST和改善蛋白代謝方面較為明顯（P＜0.05）。課題組研究了紅背葉根對卡介苗和脂多糖誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的保護作用，結(jié)果表明紅背葉根可顯著改善免疫性肝損傷小鼠的胸腺、肝臟、脾臟系數(shù)，降低血清中ALT、AST、NO的活性以及肝組織勻漿中TNF-α、IL-1β的含量，提

4、示紅背葉根對免疫性肝損傷具有顯著的保護作用。紅背葉根能顯著降低肝纖維化大鼠全血黏度150/s切變率、30/s切變率、5/s切變率、1/s切變率、紅細胞壓積、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、ALT和AST，改善纖維化大鼠舌下及耳廓絡(luò)脈的循環(huán)狀態(tài)，從而提示“活血通絡(luò)”可能是其抗纖維化的主要病機之一。更進一步研究紅背葉根水提物、醇提物和紅背葉根總生物堿對CCL4致小鼠肝損傷的作用機制發(fā)現(xiàn):紅背葉根水提物、醇提物和總生物堿均能明顯降低模型小鼠血清中A

5、LT、AST及總膽紅素水平，減輕肝細胞變性、炎細胞浸潤及壞死等病變，但其保肝機制及總生物堿的分離純化有待進一步研究。本課題組前期研究了紅背葉根3個有效部位，分別是石油醚有效部位，乙酸乙酯有效部位，正丁醇有效部位對Con-A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，可降低小鼠血清ALT、AST、TNF-α、INF-γ及肝組織MDA含量，提高肝組織SOD活力，并可改善肝臟的組織形態(tài)，其乙酸乙酯及正丁醇有效部位有體外抑制HBsAg和HBeAg作用。紅背葉根乙酸乙

6、酯有效部位體外實驗還表明乙酸乙酯有效部位可以抑制HCV的復(fù)制，為抗HCV RNA表達的活性部位。并且在預(yù)實驗中，我們通過對紅背葉根醇提物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物對肝纖維化大鼠的作用比較得出，三種有機溶劑對肝纖維化作用均不如總醇提物效果好。這提示我們紅背葉根抑制肝纖維化的作用是多種成分共同作用的結(jié)果。
　　綜合文獻參考及課題組前期研究成果，對紅背葉根中藥材進行提取和分離有效部位和有效單體進行深入研究，探知其保肝作

7、用的有效成分并探討其起效的機制。具體實驗方法擬通過體內(nèi)和體外實驗兩部分進行。
　　方法:
　　1.紅背葉根醇提物的制備工藝及質(zhì)量控制
　　本課題組根據(jù)前期實驗分析的核磁共振氫譜(H-NMR)和碳譜(13C-NMR)，結(jié)合HPLC等方法分析，結(jié)果顯示本課題組從紅背葉根中所分離的單體化合物主要為為酚酸類物質(zhì)與皂苷類物質(zhì)。本實驗研究建立了紫外分光光度法分別測定紅背葉根中藥材中總酚酸、總皂苷、總黃酮的含量。并采用RP-HPLC

8、法建立了單一有效成分沒食子酸的質(zhì)量控制方法學(xué)，并檢測了紅背葉根中丁香酸、β-谷甾醇、羽扇豆醇及沒食子酸乙酯等單體化合物的含量，初步探索了紅背葉根藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)。還篩選了指紋圖譜研究的最優(yōu)系統(tǒng)洗脫條件。
　　2.動物實驗
　　2.1 實驗動物分組動物實驗分為兩部分。實驗一為紅背葉根活性成分篩選實驗。動物分組（共13組）為:空白對照組（以下簡稱空白組），紅背葉根乙醇提取物高、中、低劑量組，正丁醇提取物高、中、低劑量組，乙酸乙酯提

9、取物高、中、低劑量組，石油醚提取物高、中、低劑量組。實驗二為紅背葉根乙醇提取物抗肝纖維化的機制研究。動物分組為:空白對照組（以下簡稱空白組）、模型組、秋水仙堿對照組及紅背葉根醇提物(AE)組。
　　2.2 動物模型的制備與給藥選用SPF級雄性SD大鼠，除去空白對照組外，其余各組按2mL/kg體重，腹腔注射40％CCL4花生油溶液(2∶3，v/v)，每周2次。正常飲食飲水，每周日稱體重并記錄，連續(xù)8周。正常組與模型組用生理鹽水灌胃，

10、干預(yù)組組分別給予相應(yīng)藥液灌胃，灌胃體積為2mL/只。
　　2.3 實驗動物樣品制備各組大鼠模型完成后，用10％水合氯醛麻醉大鼠(0.3ml/100g)，經(jīng)腹主動脈采血，4℃低溫靜置6小時后，3000rpm離心15分鐘，分離上層血清，-80℃保存?zhèn)溆?，用于檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶（ALT/AST）、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、三型前膠原(PCⅢ)、四型膠原(CⅣ)，以及轉(zhuǎn)化生長因子beta1(TGF-β1)水平、基質(zhì)

11、金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)水平;然后取出大鼠肝臟，觀察其大體形態(tài)，稱肝臟濕重計算肝臟指數(shù)。并于肝左葉中部取新鮮肝臟組織后立即用10％中性福爾馬林固定后進行病理切片處理（石蠟切片），HE染色及Masson染色，繼而進行各種免疫組化檢測(IHC)，觀察肝臟組織病理學(xué)變化，同時檢測肝組織中alpha-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及凋亡相關(guān)蛋白(Cleaved Caspase3)的表達情況;同時取相同部位的肝臟做肝組織勻漿，用于免疫印

12、跡實驗(Westem Blot analysis)，檢測肝組織中相關(guān)蛋白的表達改變。
　　3.體外細胞實驗
　　3.1 細胞毒性測試將正常肝細胞(LO2)和人源性肝星狀細胞(hHSC)分別接種于96孔板，用不同濃度的含紅背葉根醇提物(AE)培養(yǎng)基(0.0，0.3125，0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0μg/ml)培養(yǎng)24小時，加MTT液孵育4小時，去上清后加DMSO溶解甲鑚顆粒，測OD值，計算細胞半數(shù)

13、抑制率，確定紅背葉根對正常細胞的毒性范圍以及對HSC的最佳藥物濃度。
　　3.2 活化hHSC模型實驗用TGF-β1細胞因子誘導(dǎo)人源性肝星狀細胞(hHSC)活化，再用含不同濃度紅背葉根AE培養(yǎng)基孵育24小時后，收集上清液做其他檢測，收集細胞爬片做免疫組化染色，收集細胞提取蛋白做Western blot。
　　4.統(tǒng)計方法
　　采用SPSS13.0以及Graph Pad Prism5.0軟件統(tǒng)計分析并作圖，實驗結(jié)果通過均

14、值±標(biāo)準差表示。根據(jù)實驗的設(shè)計不同采用不同的統(tǒng)計方法:各組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA，方差齊性時采用LSD法進行組間多重比較，方差不齊時采用Welch法，組間多重比較采用Dunnett's T3法;重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用repeated measures分析統(tǒng)計，滿足球形檢驗時采用Sphericity Assumed，不滿足球形檢驗時采用Greenhouse-Geisser校正系數(shù);相關(guān)性分析采用Spearman'srank c

15、orrelation test。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.以沒食子酸為對照品做紫外分光光度法測得紅背葉根中藥材中總酚酸含量高達16.7％，以人參皂苷為對照品測得總皂苷含量達11.7％，以蘆丁為對照品測得總黃酮含量是15.2％。并用反相高效液相色譜法檢測了紅背葉根中的沒食子酸(0.98％)、丁香酸(0.92％)、β-谷甾醇(0.78％)，沒食子酸乙酯和羽扇豆醇因含量較低峰值過小測定值不穩(wěn)定。并且以沒食子

16、酸為對照品對紅背葉根建立質(zhì)量控制標(biāo)準及方法學(xué)研究包括:精密度試驗(RSD=0.71％)、穩(wěn)定性試驗(RSD=1.35％)、重現(xiàn)性試驗(RSD=0.8％)和準確度試驗(RSD=1.23％)。并探索了建立紅背葉根的HPLC指紋圖譜的實驗條件:乙醇可以作為溶解紅背葉根藥材的溶劑;加熱回流方法比超聲提取方法得到的HPLC圖形分離度和飽和度更優(yōu)，故以加熱回流提取法為提取方法;HPLC圖譜的最大吸收波長為228nm、273nm;流動相為乙腈(A)-

17、0.1％磷酸溶液(B)。
　　2.高劑量與中劑量的紅背葉根乙醇提取物有保護肝細胞、降低血清轉(zhuǎn)氨酶和抑制肝臟中膠原沉積的作用，并且該作用比正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取物的作用顯著。低劑量正丁醇提取物也有改善轉(zhuǎn)氨酶的作用，但對抑制膠原沉積作用不明顯。根據(jù)實驗結(jié)果，紅背葉根醇提物的有效劑量至少是0.2 g/ml。
　　3.紅背葉根醇提物對正常肝細胞的毒性很小。
　　4.CCL4腹腔注射造肝纖維化動物模型的實驗方法是可靠的。<

18、br>　　5.紅背葉根可以抑制肝纖維化的慢性進展過程。
　　6.紅背葉根可以減輕肝細胞凋亡和肝損傷。
　　7.紅背葉根可以抑制α-SMA在肝臟中的表達和血清TGF-β1水平。
　　8.紅背葉根可以抑制肝臟中TIMP-1的表達，促進MMP-3的釋放。
　　結(jié)論:
　　紅背葉根乙醇提取物具有保肝降酶，抑制肝纖維化的作用，其機制可能是通過抑制正常肝細胞凋亡，并抑制肝星狀細胞的活化增殖和促進其凋亡，從而減少細胞外基