納米TiO2對家蠶生長發(fā)育及蛋白合成的影響.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是重要的經(jīng)濟昆蟲，起源于野桑蠶（Bombyx mandarina），已有5700多年的馴養(yǎng)歷史。蠶絲業(yè)是中國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，每年的生絲產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的78％以上，我國是全球生絲的重要原產(chǎn)地。增加蠶繭的產(chǎn)量，提高生絲的品質(zhì)是發(fā)展蠶絲業(yè)的中心任務，通過家蠶品種改良，開發(fā)高效的飼養(yǎng)技術(shù)和繅絲新工藝可以增加蠶繭的產(chǎn)量和質(zhì)量。近年來，隨著納米生物技術(shù)的快速發(fā)展，以納米材料開發(fā)的飼料添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應用，在蠶業(yè)

2、生產(chǎn)上還沒有相關(guān)的研究報道。
　　納米二氧化鈦（TiO2）基于其表面效應、量子尺寸效應、體積效應和宏觀量子隧道效應等優(yōu)點而被廣泛的應用在生物領(lǐng)域。納米 TiO2的生物學效應與其濃度關(guān)系密切，高濃度的納米TiO2對生物有毒害作用，低濃度的納米TiO2作為添加劑使用可促進牲畜的生長及蛋白的合成。家蠶絲蛋白的合成能力直接影響到蠶絲的產(chǎn)量，低濃度的納米TiO2添食家蠶能否促進家蠶的生長及蛋白合成尚無報道。
　　為了研究納米TiO2能

3、否提高家蠶的生長發(fā)育和蛋白合成，本研究使用5 mg/L納米TiO2添食家蠶，調(diào)查了家蠶體重和飼料效率（食下量、消化量和消化率）。結(jié)果顯示，添食納米TiO2后體重較對照增加了4.64%，食下量增加了5.82%，消化量增加了18.63%，消化率增加了17.58%，以上表明，納米TiO2添食能夠促進家蠶的生長發(fā)育。
　　BmNPFR是家蠶獨有的G蛋白耦合的受體，它特異性的內(nèi)源性配體是BmNPF1a和BmNPF1b。BmNPFR調(diào)控家蠶的

4、攝食和生長是通過與BmNPF1a和BmNPF1b特異性的高效結(jié)合，介導受體 BmNPFR內(nèi)化，激活 ERK1/2信號通路，參與調(diào)控生理發(fā)育相關(guān)基因的表達，發(fā)揮促進家蠶攝食和生長的作用。為了進一步研究納米 TiO2促進家蠶生長發(fā)育的機制，通過對神經(jīng)肽受體BmNPFR進行RNAi，采用實時熒光定量PCR（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）檢測中腸神經(jīng)肽受體 Bm

5、NPFR、神經(jīng)肽配體 BmNPF1a和 BmNPF1b的轉(zhuǎn)錄水平；通過 western blotting檢測調(diào)控攝食和生長的ERK磷酸化蛋白MAPK，并研究神經(jīng)肽受體BmNPFR與神經(jīng)肽配體BmNPF1a、BmNPF1b的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，納米TiO2處理組中腸中BmNPFR、BmNPF1a和BmNPF1b的轉(zhuǎn)錄水平是對照的1.58倍、1.43倍和1.34倍，是BmNPFR干擾組的1.99倍、2.26倍和2.19倍。此外，納米TiO2

6、處理組中腸中MAPK蛋白較對照組高24.03%，BmNPFR-dsRNA注射組MAPK蛋白是對照組的71.00%。以上結(jié)果表明，納米TiO2通過促進中腸BmNPFR與BmNPF1a和BmNPF1b的表達和結(jié)合，增加ERK蛋白的磷酸化，激活ERK1/2信號通路，促進家蠶的生長發(fā)育。
　　生物生長發(fā)育的主要影響之一是蛋白的合成和累積，在家蠶中主要表現(xiàn)為造卵和絲蛋白合成的變化。家蠶絲蛋白合成是家蠶蛋白合成的重要部分，為了研究納米TiO2

7、處理是否影響家蠶絲蛋白的合成，調(diào)查了繭質(zhì)（全繭量、繭層量和繭層率），通過qRT-PCR、半定量PCR(Semi quantitative PCR，RT-PCR)和western blotting檢測了絲腺Fib-L基因的轉(zhuǎn)錄和表達及SGF-1的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，家蠶添食納米TiO2后全繭量較對照組增加了4.74%，繭層量較對照組增加了9.30%，繭層率較對照組增加了4.51%；結(jié)果表明，納米TiO2處理組絲腺Fib-L在5齡48 h、

8、96 h、144 h和192 h分別是對照組的1.30倍、1.29倍、3.17倍和5.93倍，絲腺轉(zhuǎn)錄因子SGF-1在5齡48 h、96 h、144 h和192 h分別是對照組的1.39倍、2.21倍、5.79倍和3.29倍；RT-PCR與western blotting結(jié)果基本與qRT-PCR結(jié)果一致。以上表明，納米TiO2處理能夠增加絲蛋白的合成。
　　為了進一步研究納米TiO2增加絲蛋白合成的機制，通過DGE（Digital

9、 Gene Expression Profiling）結(jié)果中轉(zhuǎn)錄和表達譜數(shù)據(jù)，分析納米TiO2增加絲蛋白合成的分子機制。DGE結(jié)果分析表明，共有4741個基因被檢測到，添食納米TiO2后差異表達基因306個，其中上調(diào)基因137個，下調(diào)基因169個；參與絲蛋白合成的基因106個，其中上調(diào)基因97個，下調(diào)基因9個，同時通過GO和KEGG注釋將差異表達基因進行分類。為了檢測DGE數(shù)據(jù)的可靠性，本文通過qRT-PCR驗證了8個與絲腺中蛋白合成和

10、水解關(guān)系密切基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。它們分別是3種蛋白水解和降解酶類基因：天門冬酰胺氨基葡萄糖酶（Aspartylglucosaminidase），赤擬谷盜組織蛋白酶 L（the cathepsin L inTribolium castaneum），類SPRY域包含SOCS盒子蛋白3（Similar to SPRY domain-containingSOCS box protein3）；5個蛋白合成和修飾加工酶類基因：賴氨酰-tRNA合成酶

11、（Lysyl-tRNA synthetase）、表皮富含蛋白甘氨酸10（Cuticular protein glycine-rich10）、精氨酸/絲氨酸富含剪切因子6（Splicing factor arginine/serine-rich6）、絲氨酸蛋白酶抑制劑28（Serine protease inhibitor28）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase）；其結(jié)果與DGE結(jié)果一致。這表明納米Ti

12、O2處理使絲蛋白合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，蛋白水解和降解酶類基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，推測與納米TiO2增加家蠶絲蛋白的合成有關(guān)。
　　為了研究納米 TiO2處理對絲蛋白合成的營養(yǎng)吸收和原料利用是否有累積效應，測定了5齡48 h、96 h、144 h和192 h中腸消化液的蛋白酶活性和血淋巴中的氨基酸含量。數(shù)據(jù)顯示，納米TiO2處理組48 h、96 h、144 h和192 h蛋白酶活性是對照組的2.44倍、1.77倍、2.46倍和1.3

13、3倍；組成家蠶絲蛋白的4種主要氨基酸有：甘氨酸(GLY)、丙氨酸(ALA)、絲氨酸(SER)和酪氨酸(TYR)；納米TiO2處理組與對照組相比，5齡前期合成絲蛋白的主要氨基酸含量增加，后期這些氨基酸的含量明顯下降。表明納米 TiO2處理不僅能提高家蠶中腸蛋白酶活性加強家蠶對飼料中營養(yǎng)的吸收，而且能夠提高氨基酸的轉(zhuǎn)運能力增加家蠶對絲蛋白合成原料的利用。
　　為了研究納米 TiO2對家蠶造卵相關(guān)蛋白合成的影響，調(diào)查了家蠶產(chǎn)卵數(shù)，每粒卵

14、重，生殖腺指數(shù)(Gonadosomatic index,GSI)。結(jié)果顯示，家蠶添食納米TiO2后，產(chǎn)卵數(shù)平均增加了51粒；每粒卵重增加了0.14×10-4 g；納米TiO2處理后，雌性和雄性在熟蠶時生殖腺指數(shù)與對照組相比顯著增加。以上表明，納米 TiO2處理有利于家蠶的造卵，提高卵的質(zhì)量。為了進一步研究納米 TiO2影響家蠶造卵的可能機制，通過qRT-PCR的方法對精卵巢生殖發(fā)育相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄水平的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢中促進生殖發(fā)育

15、相關(guān)基因Vg、Ovo、Ovo-781、Ovo-498、Otu、Sxl-S和Sxl-L與對照組相比，分別上調(diào)6.77倍、2.00倍、5.33倍、2.99倍、2.43倍、1.73倍和2.30倍；精巢中促進生殖發(fā)育相關(guān)基因Achi-L、Aly和Vlg與對照組相比，分別上調(diào)3.55倍、5.78倍和2.36倍，結(jié)果表明，納米TiO2處理后生殖發(fā)育相關(guān)基因表達的上調(diào)，可能與TiO2飼喂家蠶造卵數(shù)的改變有關(guān)。
　　本研究表明，低濃度納米 TiO

16、2添食家蠶首先進入中腸，提高家蠶神經(jīng)肽受體BmNPFR和神經(jīng)肽配體 BmNPF1a、BmNPF1b的轉(zhuǎn)錄表達，并促進其結(jié)合，激活家蠶ERK1/2信號通路，促進家蠶的生長發(fā)育；與此同時，納米TiO2上調(diào)絲蛋白合成相關(guān)基因，下調(diào)蛋白水解酶類基因，增加中腸蛋白酶活，提高氨基酸的轉(zhuǎn)運能力，加強絲蛋白合成轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，促進絲蛋白的合成，增加絲產(chǎn)量；此外，納米 TiO2處理后家蠶性腺發(fā)育相關(guān)基因表達上調(diào)，促進性腺的生長和發(fā)育，隨著充足營養(yǎng)的轉(zhuǎn)運和