S100A10基因沉默對人軟骨細胞炎性反應的影響.pdf

1、第一部分:shRNA表達載體構建以及有效siRNA序列篩選
　　目的:針對人S100A10基因設計siRNA序列；使用質粒表達載體構建shRNA表達載體；重組載體轉染細胞，進行有效siRNA序列的篩選。
　　方法;登陸NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫，查找人S100A10基因序列相關信息。根據(jù)S100A10(NM_002966)基因信息，使用在線siRNA序

2、列設計軟件，設計3條針對其CDS區(qū)的siRNA序列。根據(jù)設計的siRNA序列，設計兩條互補的shRNA序列，退火后連接到shRNA表達載體，構建shRNA重組表達載體。陽離子脂質體法轉染shRNA重組表達載體到慢病毒包裝細胞系（293TN細胞），根據(jù)綠色熒(GFP)光判斷細胞基因轉導效率，轉染后48小時，收集細胞，提取細胞總RNA及總蛋白，分別使用RealTime-PCR及Westernblotting的方法檢測轉染后細胞中S100A1

3、0mRNA及蛋白相對含量，分析比較得出最有效的siRNA序列。
　　結果:成功查找到S100A10的基因信息并設計siRNA序列；經(jīng)測序分析，成功構建了shRNA表達載體；mRNA及蛋白含量檢測結果顯示，三條siRNA序列對目的基因均有沉默效果，其中1號siRNA序列最為有效，其轉染組細胞內mRNA及蛋白含量相比較未轉染組細胞，分別下降了78.8％和70.5%，統(tǒng)計差異顯著（P＜0.01）。
　　結論:使用RNAi技術，可以

4、在細胞內有效沉默S100A10基因。
　　第二部分:重組慢病毒制備及軟骨細胞的慢病毒感染
　　目的:重組慢病毒的包裝和生產(chǎn)及滴度檢測；人軟骨細胞的慢病毒感染。
　　方法:使用有效shRNA(pshRNA1-S100A10)表達載體及慢病毒包裝質?；旌衔锕厕D染293TN細胞，進行重組慢病毒的包裝和生產(chǎn)。轉染后48小時，收集細胞上清液，使用微孔濾膜過濾除去蛋白碎片，分裝保存并且使用比例稀釋法檢測病毒滴度。分離培養(yǎng)人原代軟骨

5、細胞(humanchondrocytes,HCs)，預實驗確定人軟骨細胞慢病毒感染的最佳MOI值，并且按照最佳MOI值進行感染，在感染72h后，通過綠色熒光蛋白表達確定細胞基因轉導效率，收集感染后軟骨細胞，提取其總蛋白，Westernblot檢測S100A10蛋白相對含量。
　　結果:成功進行了重組慢病毒的包裝及滴度測定。成功分離培養(yǎng)人軟骨細胞。使用慢病毒途徑感染軟骨細胞，可取得較高的基因轉導效率（約90%）。通過慢病毒途徑，在人

6、軟骨細胞中成功進行了S100A10基因的沉默，蛋白檢測結果顯示，沉默效率達到了78.2%。
　　結論:通過慢病毒途徑可在人原代軟骨細胞中針對S100A10基因進行有效沉默。
　　第三部分:S100A10基因沉默對LPS誘導的人軟骨細胞炎性反應的影響
　　目的:脂多糖（LPS）誘導軟骨細胞制作體外炎性模型；S100A10基因干預對于LPS誘導的軟骨細胞炎性反應的影響檢測。
　　方法:取軟骨細胞及病毒感染后的軟骨細胞

7、，加入濃度1mg/L的LPS，誘導24、48小時后，收集細胞上清，ELISA檢測細胞上清中TNFa，IL-1β,及IL-10含量。LPS誘導48小時后，收集細胞，提取總蛋白，Westernblotting檢測MAPK炎癥調控通路。SDS-PAGE電泳分離蛋白，400mA恒流濕法轉膜，5%脫脂奶粉進行封閉，一抗4℃過夜孵育，洗膜，加入二抗室溫反應2h，添加化學發(fā)光底物，曝片后掃描底片，使用光密度分析軟件對目的條帶進行灰度值分析。通過檢測E

8、RK1/2蛋白磷酸化、P38蛋白磷酸化、JNK蛋白磷酸化及NFkB-P65蛋白磷酸化，來觀察S100A10基因沉默對于LPS誘導MAPK通路激活的影響。LPS誘導后48小時，收集細胞，流式法檢測細胞內鈣離子濃度。使用二甲基亞砜(DMSO)配制Fluo3-AM母液，使用前使用1×磷酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度。胰酶消化收集細胞，使用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3次，加入Fluo3-AM熒光探針，37℃細胞培養(yǎng)箱孵育30分鐘，除去Fluo3-AM工作液

9、，用磷酸鹽緩沖液滌細胞3次，37℃培養(yǎng)箱孵育約30分鐘，流式檢測，激發(fā)波長480~500nm，發(fā)射波長525-530nm。
　　結果:人原代軟骨細胞經(jīng)LPS誘導24、48小時后，細胞上清中炎性因子TNFa，IL-1β,及IL-10含量明顯上升，與空白細胞組比較，差異顯著（P＜0.05）；S100A10基因沉默組，LPS誘導炎性因子上升的趨勢得到了明顯抑制，與單獨LPS誘導組相比較，差異顯著（P＜0.05）；LPS誘導細胞后48小時

10、，MAPK通路的ERK1/2、P38、JNK及NFkB-P65蛋白磷酸化程度均增強，而S100A10基因沉默組，蛋白磷酸化增強的趨勢得到明顯抑制。同時，鈣離子檢測結果顯示，LPS誘導可以明顯增強軟骨細胞內鈣離子濃度，統(tǒng)計分析，差異顯著（P＜0.05），而S100A10基因沉默組細胞內鈣離子濃度則明顯低于LPS單獨誘導組，且差異顯著（P＜0.05）。
　　結論:LPS誘導人原代軟骨細胞，可明顯使細胞產(chǎn)生炎性反應。S100A10基因沉