納米二氧化硅致肺毒性及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、納米材料可以穿透血腦屏障、血眼屏障及血睪屏障，從而可能危害到生物體的安全。研究表明納米材料可以在細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平、基因、蛋白水平及整體動(dòng)物水平對(duì)生物體產(chǎn)生影響。與同種物質(zhì)微米級(jí)的顆粒比較，一般納米顆粒的生物活性更強(qiáng)，對(duì)機(jī)體的潛在危害也可能更大。
　　 2009年9月北京朝陽醫(yī)院宋玉果的研究團(tuán)隊(duì)在《歐洲呼吸病學(xué)雜志》(Eur Respir J2009，34(3)：559)上發(fā)表了題為《暴露于納米顆粒環(huán)境中可能造成胸腔積液、肺纖

2、維化和肉芽腫》的論文，首次報(bào)告了納米顆粒致人死亡的案例。引起了歐美多國專家的熱議和質(zhì)疑，《Nature》也在線發(fā)表了一篇社論文章關(guān)注此事。該研究把關(guān)于納米技術(shù)的健康風(fēng)險(xiǎn)的爭(zhēng)論推上了新的高潮，納米顆粒能否損傷肺組織也激起了熱烈的討論。
　　 納米SiO2作為納米材料家族中的重要一員，是目前世界上大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)量最高的一種納米粉體材料，其產(chǎn)品己廣泛應(yīng)用于電子封裝材料、高分子復(fù)合材料、塑料、涂料、橡膠改性、顏料、陶瓷、膠粘劑、玻

3、璃鋼、藥物與基因傳遞復(fù)合載體、生物傳感器、化妝品及抗菌材料等幾乎涉及微米SiO2粉體的所有領(lǐng)域。隨著納米SiO2應(yīng)用領(lǐng)域的拓寬，研究者、生產(chǎn)者和消費(fèi)者經(jīng)呼吸道、口和皮膚等途徑接觸的機(jī)會(huì)和水平不斷增加。因其生物安全性尚不確定，所以該方面的研究也是各國學(xué)者、有關(guān)管理部門及社會(huì)公眾的廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 眾所周知以石英為代表的微米SiO2是典型的肺毒物，可引起矽肺和肺癌。在我國已有累計(jì)超過60萬的矽肺病人，每年還在以新發(fā)1萬多例的病

4、例數(shù)增長(zhǎng)，與之有相同化學(xué)組分的納米SiO2是否具有與石英一樣的毒性?為避免重蹈微米SiO2嚴(yán)重危害勞動(dòng)者健康的覆轍，開展納米SiO2的肺毒性研究將十分必要。
　　 本研究以微米SiO2為陽性對(duì)照，通過體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞染塵及體內(nèi)經(jīng)氣管灌注大鼠染塵的方法，從細(xì)胞和整體動(dòng)物兩個(gè)水平研究納米SiO2的肺毒性作用并探討其機(jī)制，為充分認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)納米SiO2的安全性、科學(xué)生產(chǎn)和應(yīng)用及今后制訂防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)等諸多方面提供基礎(chǔ)毒理學(xué)資料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

5、
　　 1．應(yīng)用MTT法測(cè)定納米和微米SiO2粒子對(duì)RAW264.7細(xì)胞染毒24h的IC50分別為5.08mg/m1和16.69mg/ml;納米和微米SiO2在31.25～8000μg/ml劑量范圍內(nèi)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞染毒8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h和72h后，細(xì)胞活力降低，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，500、2000、8000μg/ml納米SiO2染毒組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線較同劑量微米SiO2降低

6、得更早、更明顯，RT-CES系統(tǒng)和MTT法在評(píng)定細(xì)胞毒性方面具有較好的一致性；光學(xué)和熒光顯微鏡下觀察到500μg/ml納米及微米SiO2可致貼壁細(xì)胞數(shù)量減少、體積增大、呈氣球樣變，納米SiO2染毒后，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少更明顯，細(xì)胞形態(tài)趨于不規(guī)則形，部分細(xì)胞開始崩解。透射電鏡下觀察到微米SiO2粒子染毒RAW264.7細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、嵴斷裂、胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，納米SiO2引起上述細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常改變的程度較微米SiO2重，且細(xì)胞染色質(zhì)固縮，

7、細(xì)胞核呈致密濃染。能譜儀分析顯示染毒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中吞噬泡內(nèi)的顆粒和細(xì)胞間隙的顆粒均含有Si元素。
　　 利用丙酮酸法測(cè)定125、250、500μg/ml納米及微米SiO2染毒RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高，呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，三個(gè)劑量的納米SiO2染毒組RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量高于微米SiO2(P＜0.05);應(yīng)用FRAP技術(shù)，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)125、500μg/ml納米SiO2與500μg

8、/ml微米SiO2組細(xì)胞膜熒光恢復(fù)率及細(xì)胞膜擴(kuò)散系數(shù)低于陰性對(duì)照組，500μg/ml納米SiO2組及微米SiO2組的細(xì)胞膜熒光恢復(fù)率和細(xì)胞膜擴(kuò)散系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)Ca2+敏感探針Fluo-3/AM與激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合檢測(cè)125、500μg/ml納米SiO2組與500μg/ml微米SiO2細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]j含量在100s、200s、300s、400s、500s和600s的各作用時(shí)間點(diǎn)均高于陰性對(duì)照組，500μg/ml納米Si

9、O2組及微米SiO2組的細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；500μg/ml納米與微米SiO2染毒RAW264.724h用Hoechst33258熒光染色和Annexin V-PI雙染法均可見調(diào)亡細(xì)胞，125、500μg/ml納米SiO2及500μg/ml微米SiO2粒子致RAW264.7細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組；運(yùn)用PI染色流式細(xì)胞儀測(cè)定125μg/ml納米SiO2粒子致細(xì)胞增殖指數(shù)降低及G0/G1期細(xì)胞增多，500μg/ml納

10、米SiO2粒子及微米SiO2致細(xì)胞增殖指數(shù)降低及G0/G1期、S期細(xì)胞增多，500μg/ml納米SiO2組及微米SiO2組細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖指數(shù)及各周期分布情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化測(cè)定結(jié)果顯示，500μg/ml納米SiO2粒子及微米SiO2染毒細(xì)胞內(nèi)MDA，H2O2，·OH，O2·ˉ，NO水平顯著升高，納米SiO2染毒細(xì)胞O2·水平高于微米SiO2;DCFH-DA熒光探針與激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合測(cè)定125μg/ml、50

11、0μg/ml納米SiO2及500μg/ml微米SiO2可致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，500μg/ml納米SiO2組所致細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于同劑量微米SiO2組。提示與微米SiO2化學(xué)組成相同的納米SiO2具有與其相似的細(xì)胞毒性作用，由于粒徑小，表面大量羥自由基的存在，作用于巨噬細(xì)胞后引發(fā)呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量ROS，參與細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，這些自由基以各種方式攻擊細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，細(xì)胞膜對(duì)LD

12、H的通透性增高，細(xì)胞內(nèi)外離子交換障礙，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞發(fā)生凋亡，增殖周期出現(xiàn)異常，從而引起細(xì)胞損傷，納米SiO2的細(xì)胞毒性較微米SiO2強(qiáng)。
　　 2.125μg/ml、500μg/ml納米SiO2及500μg/ml微米SiO2可致RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、TGF-β1及IL-1β的生成量增加，500μg/ml納米SiO2與微米SiO2致上述細(xì)胞因子生成量無差別，500μg/ml納米SiO2組MMP-2陽性表

13、達(dá)率高于同濃度微米SiO2組；RAW264.7細(xì)胞在以上濃度納米SiO2及微米SiO2染毒24h后，培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)CHL細(xì)胞增殖率、產(chǎn)生羥脯氨酸的量及MMP-2陽性表達(dá)率較陰性對(duì)照組增加，500μg/ml納米SiO2組的CHL細(xì)胞增殖率與相同濃度微米SiO2組無差別，而產(chǎn)生羥脯氨酸的含量及MMP-2陽性表達(dá)率高于相同濃度微米SiO2組；隨納米SiO2染毒濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞生成細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β1及IL-1β的量

14、及CHL細(xì)胞增殖率、生成羥脯氨酸的量、MMP-2陽性表達(dá)率升高。說明納米SiO2在介導(dǎo)AMs方面具有與微米SiO2一樣的作用，即激活A(yù)Ms，通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)使FB增殖及膠原合成與分泌增加，同時(shí)促進(jìn)CHL細(xì)胞MMP-2高表達(dá)，不斷降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與肺泡基底膜損傷，從而啟動(dòng)肺組織纖維化的發(fā)生。
　　 3．采用一次性氣管灌注方式，以50mg/ml的劑量對(duì)雄性Wistar大鼠進(jìn)行納米和微米SiO2灌注1ml染塵，24h內(nèi)納米SiO2染

15、塵組大鼠因肺水腫而陸續(xù)死亡，而微米SiO2在急性毒性的觀察期7天內(nèi)未見異常反應(yīng)，故本實(shí)驗(yàn)以25mg/ml為最高劑量一次灌注大鼠1ml，染塵30天后發(fā)現(xiàn)25mg/ml微米和納米SiO2組雙肺腫大，肺組織臟器系數(shù)較對(duì)照組及6.25、12.5mg/ml的納米SiO2組增加，25mg/ml納米SiO2組大鼠肺組織臟器系數(shù)高于對(duì)照組但低于同濃度微米SiO2組；25mg/ml微米SiO2染塵組大鼠出現(xiàn)肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞輕度浸潤(rùn)，細(xì)胞性結(jié)節(jié)

16、形成、膠原纖維增多的病理改變，25mg/ml納米SiO2染塵組大鼠未形成明顯結(jié)節(jié)，病理改變較微米SiO2組輕微；25mg/ml微米和納米SiO2染塵大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖，排出嗜鋨板層小體，肺泡巨噬細(xì)胞大量增生、吞噬塵粒、脂質(zhì)和嗜鋨小體的改變；透射電鏡和能譜儀結(jié)合檢測(cè)發(fā)現(xiàn)灌肺后24h內(nèi)微米SiO2染塵組大鼠尿液中有少量粒子排出，而納米SiO2染塵組大鼠尿液中有大量粒子排出；6.25、12.5、25mg/ml納米Si

17、O2及25mg/ml微米SiO2染塵組大鼠肺組織MDA生成量及MMP-2表達(dá)量增加，12.5、25mg/ml納米SiO2及25mg/ml微米SiO2染塵組大鼠肺組織NO、羥脯氨酸生成量增加，25mg/ml微米SiO2組NO、羥脯氨酸的生成量及TNF-α、IL-1β及MMP-2的表達(dá)量高于同濃度納米SiO2組；流式細(xì)胞儀測(cè)定12.5、25mg/ml納米SiO2及25mg/ml微米SiO2組肺細(xì)胞凋亡率增加，25mg/ml微米SiO2組肺細(xì)

18、胞凋亡率高于同濃度納米SiO2組，6.25、12.5、25mg/ml納米SiO2及25mg/ml微米SiO2致G1期細(xì)胞增多，S期、G2/M期及細(xì)胞增殖指數(shù)降低，25mg/ml微米SiO2組G1期、S期細(xì)胞及細(xì)胞增殖指數(shù)高于同濃度納米SiO2組。提示納米SiO2經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺部后，與微米SiO2一樣，在AMs脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的介導(dǎo)和釋放TNF-α、TGF-β1、IL-1β等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)下，導(dǎo)致肺部炎癥、肺泡損傷及膠原代謝紊亂，細(xì)胞外基質(zhì)

19、沉積，從而導(dǎo)致肺纖維化。
　　 以上結(jié)果提示在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，納米SiO2粒子與微米SiO2一樣可通過誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用引起細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞膜流動(dòng)性下降及通透性升高、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平增高，細(xì)胞凋亡率增高，細(xì)胞周期異常，從而使體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制、結(jié)構(gòu)和功能受到損傷；納米SiO2刺激RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)上清可致細(xì)胞因子TGF-β1、IL-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2釋放量增加，由

20、此促進(jìn)CHL細(xì)胞增生，膠原合成增多，具有潛在的致纖維化作用。其細(xì)胞毒性納米SiO2高于微米SiO2。整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，納米SiO2也可通過誘導(dǎo)經(jīng)呼吸道染塵大鼠肺組織脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，介導(dǎo)細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β1、IL-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2表達(dá)增加以及肺細(xì)胞凋亡率增加、細(xì)胞周期改變，引發(fā)肺組織損傷，導(dǎo)致肺臟器系數(shù)增加、肉芽腫結(jié)節(jié)形成、肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量增高，發(fā)生纖維化，但由于納米SiO2粒子粒徑小，易于擴(kuò)散進(jìn)入肺