脂筏相關(guān)的丙型肝炎病毒基因復(fù)制復(fù)合體的研究.pdf

1、已知正鏈RNA病毒基因復(fù)制多定位在宿主內(nèi)的特定膜結(jié)構(gòu)上，由病毒RNA、病毒蛋白與宿主蛋白相互作用并對宿主膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，形成膜相關(guān)的病毒基因復(fù)制復(fù)合體。目前認(rèn)為HCV的基因復(fù)制也采用類似的機(jī)制，在Golgi體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上起始，由HCVRNA、病毒蛋白與宿主蛋白形成多成分復(fù)合體。已有文獻(xiàn)報道HCV可通過其非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主蛋白hVAP33的相互作用，在類似脂筏的結(jié)構(gòu)上組裝病毒基因復(fù)制復(fù)合體。 為進(jìn)一步研究HCV基因復(fù)制復(fù)合體(Rep

2、licationcomplexes，RC)的組成及其參與HCV復(fù)制調(diào)控的機(jī)理，本文首先應(yīng)用HCV的亞基因組復(fù)制子模型(下簡稱復(fù)制子)，用不連續(xù)蔗糖梯度分離復(fù)制子細(xì)胞中的脂筏成分，Westernblot及RT—PCR分析結(jié)果顯示HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3，NS5A和NS5B及基因組與脂筏的標(biāo)志蛋白caveolin-2分布一致，提示其分布于脂筏成分。進(jìn)一步用脂筏刪除試劑mpCD處理復(fù)制子細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白及其正、負(fù)鏈RNA在脂筏上的

3、定位明顯減少，且HCVNS5A蛋白與已知HCVRC組分之一hVAP33蛋白的共定位消失，確認(rèn)HCVRC存在于脂筏成分。將分離獲得的脂筏成分蛋白用雙向電泳分離，各蛋白點(diǎn)胰酶消化后用MALDI—TOF(matrix-assistedlaserdesorption／ionization-timeofflightmassspectrometry)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。共鑒定出325個蛋白點(diǎn)，主要包括線粒體蛋白、信號分子、胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍?、?xì)胞骨架蛋白、參與

4、翻譯及RNA加工的蛋白等。其中包括已經(jīng)報道的與HCV基因組發(fā)生相互作用的蛋白如actin，eIF3-subunit2，elF3-P44，UNRprotein，HnRNPK，HnRNPGHnRNPL，UNR-intemctingproteins等；及與HCV蛋白發(fā)生相互作用的蛋白如Histone，14-3-3protein，F(xiàn)YN，ApoE和cyclophilinB等。 為確定脂筏蛋白中可能與HCV發(fā)生聯(lián)系的蛋白，先利用生物信息學(xué)

5、以已有的蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，結(jié)合最近發(fā)表的文獻(xiàn)，對鑒定到的蛋白間的相互作用進(jìn)行整理，得到相互作用圖譜。結(jié)果顯示蛋白相互作用圖譜中與HCV發(fā)生聯(lián)系的蛋白主要是細(xì)胞骨架蛋白，信號分子及HnRNP。此外，利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)，以復(fù)制子細(xì)胞的母細(xì)胞系Huh7作為對照，在復(fù)制子的脂筏蛋白中有60個蛋白發(fā)生上調(diào)，其中包括在蛋白相互作用圖譜中與HCV發(fā)生聯(lián)系的蛋白，如HSC71，T-complexprotein和elF3。再在復(fù)制子細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染

6、DsRed融合的脂筏蛋白，共聚焦分析是否與HCVNS5A共定位。結(jié)果顯示ubiquitinfusiondegradationproteinlhomolog(UFDlL)，SNAP-γ，sytaxinl7，PA28β，Ras-GTPase-activatingproteinbindingprotein1(G3BPl)和nucleo曲osmin(NPM)可與NS5A發(fā)生共定位。鑒于SNAP-y與sytaxinl7和hVAP33同為SNARE

7、家族成員，進(jìn)一步用N-ethylmaleimide-sensitivefactor(NSF)的永久失活體(NSF-DN)在復(fù)制子中抑制SNARE-介導(dǎo)的膜運(yùn)輸，發(fā)現(xiàn)NSF-DN能解離HCVRC，抑制HCV的復(fù)制。另外，在復(fù)制子中用針對G3BPI的siRNA干擾G3BPl的表達(dá)，顯示可下調(diào)HCV的復(fù)制(p=0.027)，提示G3BPl可能為HCVRC的潛在成分進(jìn)一步蛋白相互作用顯示G3BPl與HCVNS5B相互作用；且定位于脂筏。