丙型肝炎病毒NS2TP基因調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 NS2TP基因是抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)篩選出的HCVNS2反式激活的基因之一。本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)HCV NS2反式激活NS2TP基因從翻譯水平和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而定位NS2TP基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域，并初步探究了NS2TP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)HCV NS2對(duì) NS2TP基因反式激活作用的驗(yàn)證。首先，運(yùn)用pcDNA3.1(-)-NS2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以pc

2、DNA3.1(-)為陰性對(duì)照組。提取總蛋白、總RNA，然后分別從翻譯水平，即Westem Blot實(shí)驗(yàn)，和轉(zhuǎn)錄水平，即進(jìn)行Real-timePCR實(shí)驗(yàn)。分析和研究NS2對(duì)NS2TP基因的反式激活作用。
　　 (2)NS2TP基因啟動(dòng)子的活性分析與核心區(qū)的確定。首先，成功構(gòu)建pGL4.10-NS2TP啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體系統(tǒng)，運(yùn)用構(gòu)建的不同截短型載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，在對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)確定了NS2T

3、P基因啟動(dòng)子活性的核心區(qū)域，同時(shí)也分析了NS2對(duì)NS2TP基因啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用。
　　 (3)NS2TP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CREB作用啟動(dòng)子核心區(qū)的驗(yàn)證。運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)分析了啟動(dòng)子的核心區(qū)，識(shí)別CREB因子結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)EMSA、ChIP、CREB位點(diǎn)突變、過(guò)表達(dá)CREB蛋白和特異性抑制CREB實(shí)驗(yàn)，研究轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CREB是否參與了NS2TP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Real-time P

4、CR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HCV NS2上調(diào)NS2TP基因的轉(zhuǎn)錄水平，WesternBlot實(shí)驗(yàn)，證實(shí)HCV NS2促進(jìn)NS2TP的表達(dá)。
　　 (2)NS2TP基因最小的啟動(dòng)子活性區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游257個(gè)核苷酸(-257-bp至+93-bp)內(nèi)，同時(shí)我們也驗(yàn)證了NS2上調(diào)NS2TP基因啟動(dòng)子的活性。
　　 (3)通過(guò)EMSA和ChIP，證實(shí)CREB為NS2TP基因主要轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)蛋白。CREB位點(diǎn)突變、過(guò)表達(dá)CREB和特異