創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白細胞毒活性相關分子機制的實驗研究.pdf

1、目的： 1、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白(rVvhA)誘導人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells，humanECV304)凋亡的作用。 2、研究創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白(rVvhA)誘導人ECV304細胞(人臍靜脈內皮細胞)凋亡過程中caspase-3，-8，-9活性變化。 3、為探索創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(vibrovulnificuscytolysin，VVC)的

2、細胞毒性分子機制提供一些實驗依據(jù)。 方法： 1、誘導含pET-28a(+)vvhA重組質粒的BL21大腸桿菌表達創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白，應用Ni2+親和層析方法對rVvhA進行純化：利用分步稀釋加透析相結合的方法進行蛋白質復性。 2、將復性后的rVvhA作用綿羊紅細胞懸液，觀察細胞溶血情況來初步評價復性效果。 3、將rVvhA作用于人ECV304細胞，應用MTT法、Hochest33342/PI熒光雙染

3、、流式細胞術及DNA瓊脂糖凝膠電泳分析rVvhA對人。ECV304細胞誘導凋亡的影響；比色法測定rVvhA誘導人ECV304凋亡過程中caspase-3，-8，-9活性變化，初步評價rVvhA的生物學活性。 結果： 1、含pET-28at(+)vvhA重組質粒的BL21大腸桿菌經(jīng)0.5mmol/LIPTG誘導后表達的融合蛋白Mr約為54kDa，電泳結果與該融合蛋白的理論推算值基本相符。表達蛋白質經(jīng)三步洗滌后，再經(jīng)Ni2+

4、-NTA柱純化，其純度達88.6％左右。 2、純化的rVvhA經(jīng)復性液復性后，將復性后的rVvhA作用綿羊紅細胞懸液后發(fā)現(xiàn)，rVvhA具有溶血活性，其活性呈時間-劑量依賴性。 3、MTT結果顯示rVvhA具有降低人ECV304細胞的存活率活性，呈劑量依賴性：濃度為2.0HU/mlrVvhA作用于人ECV304.12h后，其誘導凋亡的活性高于對照組和濃度為0.5HU/mlrVvhA處理組，具有劑量依賴性；濃度為2.0HU/

5、mlrVvhA處理組加用40μMcaspase全酶抑制劑(Z-VAD-FMK)后凋亡率較2.0HU/mlrVvhA處理組有一定程度降低；濃為2.0HU/mlrVvhA處理人ECV304細胞0.5h后caspase-3活性開始增高，于3h達高峰，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，caspase-8，-9活性無明顯變化。 結論： 本實驗證實，rVvhA具有誘導人ECV304活的生物學活性，capase全酶抑劑(Z