創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白細(xì)胞毒活性相關(guān)分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白(rVvhA)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，humanECV304)凋亡的作用。 2、研究創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白(rVvhA)誘導(dǎo)人ECV304細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)凋亡過(guò)程中caspase-3，-8，-9活性變化。 3、為探索創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(vibrovulnificuscytolysin，VVC)的

2、細(xì)胞毒性分子機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、誘導(dǎo)含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌表達(dá)創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白，應(yīng)用Ni2+親和層析方法對(duì)rVvhA進(jìn)行純化：利用分步稀釋加透析相結(jié)合的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性。 2、將復(fù)性后的rVvhA作用綿羊紅細(xì)胞懸液，觀察細(xì)胞溶血情況來(lái)初步評(píng)價(jià)復(fù)性效果。 3、將rVvhA作用于人ECV304細(xì)胞，應(yīng)用MTT法、Hochest33342/PI熒光雙染

3、、流式細(xì)胞術(shù)及DNA瓊脂糖凝膠電泳分析rVvhA對(duì)人。ECV304細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響；比色法測(cè)定rVvhA誘導(dǎo)人ECV304凋亡過(guò)程中caspase-3，-8，-9活性變化，初步評(píng)價(jià)rVvhA的生物學(xué)活性。 結(jié)果： 1、含pET-28at(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌經(jīng)0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的融合蛋白Mr約為54kDa，電泳結(jié)果與該融合蛋白的理論推算值基本相符。表達(dá)蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌后，再經(jīng)Ni2+

4、-NTA柱純化，其純度達(dá)88.6％左右。 2、純化的rVvhA經(jīng)復(fù)性液復(fù)性后，將復(fù)性后的rVvhA作用綿羊紅細(xì)胞懸液后發(fā)現(xiàn)，rVvhA具有溶血活性，其活性呈時(shí)間-劑量依賴性。 3、MTT結(jié)果顯示rVvhA具有降低人ECV304細(xì)胞的存活率活性，呈劑量依賴性：濃度為2.0HU/mlrVvhA作用于人ECV304.12h后，其誘導(dǎo)凋亡的活性高于對(duì)照組和濃度為0.5HU/mlrVvhA處理組，具有劑量依賴性；濃度為2.0HU/

5、mlrVvhA處理組加用40μMcaspase全酶抑制劑(Z-VAD-FMK)后凋亡率較2.0HU/mlrVvhA處理組有一定程度降低；濃為2.0HU/mlrVvhA處理人ECV304細(xì)胞0.5h后caspase-3活性開始增高，于3h達(dá)高峰，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，caspase-8，-9活性無(wú)明顯變化。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，rVvhA具有誘導(dǎo)人ECV304活的生物學(xué)活性，capase全酶抑劑(Z