副溶血性弧菌及其毒力相關(guān)因子誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的分子與細(xì)胞機(jī)理研究.pdf

1、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種食源性致病菌，廣泛分布于貝類及各種海產(chǎn)品中。Vp致病性菌株會(huì)引起傷口感染、敗血癥，或急性胃腸炎等疾病，出現(xiàn)腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心和腹部絞痛等，通常直接生食或半生食海產(chǎn)品，或者食用經(jīng)Vp交叉感染的其他食品均會(huì)引發(fā)Vp食物中毒，可使免疫功能不全的人群引起嚴(yán)重的疾病，甚至死亡。Vp致病性菌株是引起亞洲國(guó)家，包括日本、中國(guó)等，食源性疾病的主要原因之一，也是在美國(guó)發(fā)生的海產(chǎn)

2、品引起胃腸炎的主要原因。自2001以來(lái)，由于食用海產(chǎn)品引起的弧菌感染發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅公共健康。近年來(lái)，弧菌疾病爆發(fā)造成的水污染嚴(yán)重影響了個(gè)人、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)以及公共健康衛(wèi)生。O3∶K6血清型作為Vp流行性菌株最主要的血清型，可產(chǎn)生耐熱性直接溶血素(TDH)或耐熱性相關(guān)溶血素(TRH)。Vp具有兩套Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SSs(Ⅰ，Ⅱ)，可分泌效應(yīng)蛋白到宿主細(xì)胞質(zhì)，引起細(xì)胞毒性和腸毒性。研究表明Vp大流行株中存在毒力島(VpaIs)，可引起

3、人和動(dòng)物的腸道積水、水性腹瀉等疾病。盡管目前Vp引起腹瀉的具體機(jī)制尚不清楚，但腸道疾病與毒力特性（如黏附性）和其他毒力因子（如胞外酶、毒素TDH/TRH）有關(guān)。這些毒力因子為細(xì)胞毒素和腸毒素，已被多種細(xì)胞模型和動(dòng)物模型證實(shí)，然而，毒力因子是否具有宿主特異性仍不清楚。而且，Vp流行菌株的原宿主鮮有報(bào)道，其主要原因是與其它食源性疾病相比，對(duì)致病性的不完全理解，包括環(huán)境、海產(chǎn)品分離株與臨床分離株的聯(lián)系。VP感染與社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀態(tài)、氣象改變、供水質(zhì)

4、量以及公共環(huán)境衛(wèi)生并沒(méi)有相關(guān)性。比較研究流行菌株和非流行菌株的差異性，雖可顯示流行菌株的演變，但目前尚不能明確地闡明其出現(xiàn)的原因。本研究利用非吞噬細(xì)胞系建立了體外細(xì)胞感染模型，比較了副溶血性弧菌臨床分離菌株與環(huán)境菌株誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)及其評(píng)價(jià)指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)Vp基因組中的部分推測(cè)的與致病性相關(guān)的基因進(jìn)行了敲除，研究其對(duì)細(xì)胞毒性和腸毒性的影響及其可能的作用機(jī)制，并應(yīng)用幼兔感染模型進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。通過(guò)體外免疫試驗(yàn)對(duì)副溶血性弧菌的先天性免疫

5、特性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果為Vp菌株的毒力評(píng)價(jià)及致病性分子機(jī)制的理解提供了新的方法與依據(jù)。
　　我們對(duì)5株副溶血性弧菌菌株的毒力基因tdh、trh、tlh和orf8以及生長(zhǎng)特征進(jìn)行研究，結(jié)果顯示分離株Vp024、Vp038和大流行株RIMD2210633（血清型O3∶K6）具有相同的基因型，均為tlh+tdh+trh-orf8+，分離株Vp005基因型為tlh+tdh+trh-orf8-，分離株Vp029 tlh+tdh-trh-o

6、rf8-，菌株Vp038在37℃有氧培養(yǎng)條件下顯示了較高的最大群體密度，其它菌株具有相似的生長(zhǎng)特性，所有菌株在0-2h內(nèi)增殖倍數(shù)沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)。應(yīng)用非吞噬細(xì)胞系Caco-2建立體外感染模型測(cè)定了5株分離株的細(xì)胞毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn):細(xì)胞在感染后的不同階段和不同菌株之間差異程度不同，其中感染60min，不同菌株的黏附指數(shù)和侵襲指數(shù)均具有顯著差異，分離株Vp024和Vp005黏附指數(shù)顯著高于其它菌株(p＜0.05);Vp024的侵襲

7、指數(shù)顯著高于對(duì)照菌株和其它分離株(p＜0.01)，但感染180min后菌株間差異性不顯著。對(duì)模型細(xì)胞的胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、pH、鈣離子(Ca2+)以及線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平測(cè)定結(jié)果顯示:Caco-2細(xì)胞感染副溶血性弧菌后，胞內(nèi)Ca2+水平明顯增加，NO水平顯著下降，但不同菌株

8、之間沒(méi)有顯著差異;但胞內(nèi)ROS、pH和MMP水平變化具有菌株依賴性。對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡結(jié)果顯示，分離株Vp024、Vp005和Vp029共培養(yǎng)3h誘導(dǎo)凋亡率顯著高于大流行株RIMD2210633。我們的研究結(jié)果表明所有副溶血性弧菌（包括大流行株和環(huán)境株）均能黏附和侵入非吞噬性上皮細(xì)胞，并且能夠通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS在胞內(nèi)存活和復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷，這種副溶血性弧菌誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷并不依賴于經(jīng)典的細(xì)胞凋亡機(jī)制。
　　在此基礎(chǔ)上我們通過(guò)構(gòu)建R

9、IMD2210633基因缺失株以及體外細(xì)胞模型進(jìn)一步研究了宿主細(xì)胞對(duì)毒力相關(guān)基因VPA1656、VP2118和VPA1321的反應(yīng)，及其可能的致病性分子機(jī)制?；【F調(diào)節(jié)受體蛋白編碼基因VPA1656在正常情況對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞毒性和腸毒性沒(méi)有影響。鐵調(diào)節(jié)受體蛋白編碼基因VPA1656與該菌在體內(nèi)鐵離子攝取有關(guān)，在鐵限制的條件下，通過(guò)利用胞內(nèi)鐵元素作為鐵離子來(lái)源，造成細(xì)胞損傷。我們構(gòu)建了RIMD2210633基因缺失株(RIMDΔ VPA

10、1656)并比較研究了VPA1656基因缺失株和野生型菌株的細(xì)胞毒性和腸毒性。結(jié)果表明突變株也能夠黏附和侵入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，感染細(xì)胞的ROS、NO和胞內(nèi)pH參數(shù)下降水平顯著高于未感染細(xì)胞，Ca+2和MMP水平顯著高于對(duì)照細(xì)胞。而突變株誘導(dǎo)的LDH釋放和細(xì)胞死亡率和親本株沒(méi)有顯著區(qū)別。此外在幼兔體內(nèi)感染模型中，細(xì)菌的定植、存活以及腸液積水率均與親本株沒(méi)有顯著區(qū)別，組織病理學(xué)觀察顯示突變株和親本株均能夠引起感染動(dòng)物大部分腸道的壞死。

11、　　在Vp基因組中有三個(gè)基因與Vp的抗氧化性脅迫有關(guān)，其中VP2118是抗氧化脅迫的主要基因，但是VP2118與其在胞內(nèi)的存活和致病性的關(guān)系尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)胞中的活性氧水平對(duì)副溶血性弧菌的胞內(nèi)存活具有重要作用。為了理解VP2118基因?qū)Ω比苎曰【陌麅?nèi)存活和致病性的作用。我們構(gòu)建了VP2118基因敲除菌株(RIMDΔVP2118)并研究了突變株在體外Caco-2細(xì)胞模型和幼兔模型中的毒性。結(jié)果顯示RIMDΔVP2118的SOD

12、活性顯著降低，并且通過(guò)基因互補(bǔ)可以回復(fù)突變。與野生菌株相比，RIMDΔ VP2118黏附和侵襲指數(shù)以及對(duì)ROS的抵抗力顯著降低，通過(guò)VP2118基因互補(bǔ)可恢復(fù)感染能力。RIMDΔVP2118對(duì)非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)顯著下降，誘導(dǎo)LDH、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞死亡率顯著降低于親本株;而且，細(xì)菌在體內(nèi)的生長(zhǎng)和存活率相對(duì)于親本株有所下降;突變株誘導(dǎo)幼兔腸液積水率顯著降低，組織病理觀察顯示:感染野生菌株的幼兔腸道細(xì)胞壞死，而感染RIMDΔVP211

13、8的幼兔大部分腸道內(nèi)壁僅出現(xiàn)局部輕微的細(xì)胞壞死。RIMDΔVP2118感染人非吞噬細(xì)胞，可刺激產(chǎn)生促炎因子和抗炎細(xì)胞因子的分泌，與親本株相比，突變株誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放顯著減弱（p＜0.01）。通過(guò)對(duì)比分析我們還發(fā)現(xiàn)體外的細(xì)胞毒性參數(shù)與幼兔模型中的腸毒性參數(shù)（體內(nèi)細(xì)菌存活率和腸液累積率）呈正相關(guān)。結(jié)果表明FeSOD基因(VP2118)主要通過(guò)提高副溶血性弧菌對(duì)非吞噬性腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的ROS抗性，在動(dòng)物模型中提高了Vp在腸道中的存活率，進(jìn)一

14、步提高了對(duì)宿主組織感染能力。
　　VPA1321編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，與Yersinia spp.和致病性大腸桿菌的細(xì)胞毒素高度同源，被認(rèn)為是主要的細(xì)胞毒性相關(guān)因子，但是我們的研究結(jié)果表明VPA1321對(duì)Vp在體外細(xì)胞感染模型中的毒力并沒(méi)有起主導(dǎo)作用。VPA1321基因敲除菌株(RIMD△VPA1321)與親本株具有顯著差異性，突變株的細(xì)胞侵襲能力顯著下降;但仍然具有黏附細(xì)胞單層的能力。此外突變株在調(diào)節(jié)體外細(xì)胞模型參數(shù)(ROS

15、，NO，pH，Ca+2，和MMP)以及誘導(dǎo)細(xì)胞釋放LDH等方面和親本株沒(méi)有顯著差異，親本株和突變株均能夠?qū)е峦暾?xì)胞的破壞。
　　本論文利用FACS研究了Vp臨床分離株對(duì)非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。腸道致病菌獲得逃避宿主的先天性反應(yīng)的適應(yīng)性有助于其致病能力，并且防止其被快速消除，Vp的致病性是基于其黏附和入侵，我們通過(guò)感染細(xì)胞中ROS的變化證實(shí)增大Vp的ROS抵抗能力可促進(jìn)Vp在腸道中的存活，抑制宿主的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)組織感染。幼