FOXO3a-ChK3-XRCC1在納米二氧化鈦誘導(dǎo)L02細胞DNA損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、目的:納米二氧化鈦(nanoparticle titanium dioxide，Nano-TiO2)作為一種新型光催化劑、抗紫外線劑和光電效應(yīng)劑而被廣泛用在化妝品、抗菌防霉、環(huán)境污染治理、抗老化和汽車表面漆等領(lǐng)域。近來研究表明Nano-TiO2暴露于小鼠，以其小粒徑可穿透細胞膜進入細胞內(nèi)誘發(fā)炎癥反應(yīng)進而導(dǎo)致DNA受損，Nano-TiO2甚至可以穿透核膜進入細胞核，直接與遺傳物質(zhì)DNA結(jié)合形成加合物，從而大大增加接觸者患腫瘤的風(fēng)險。不同晶

2、型和表面特征的Nano-TiO2對多種體外培養(yǎng)的細胞均可造成不同程度的DNA損傷（包括DNA斷裂、微核形成、DNA加合物形成等），這不僅和納米顆粒本身的物理特性有關(guān)，還和納米材料所致的遺傳毒作用機制密切相關(guān)。
　　雖然目前的研究對Nano-TiO2所引起的DNA損傷特點和類型進行了較為細致的研究，但是其中所涉及的分子機制至今尚未闡明，因此對于Nano-TiO2誘導(dǎo)DNA損傷的可能機制成為人們關(guān)注的焦點。
　　方法:
　

3、　1.細胞培養(yǎng)及細胞模型建立
　　人胚肝細胞株L02(中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心)于含10％熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)。選對數(shù)生長期的細胞，用粒徑為25nm的Nano-TiO2染毒處理24小時，劑量為0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL;以DMEM為陰性對照。
　　2.細胞形態(tài)觀察
　　通過倒置顯微鏡觀察Nano-TiO2染毒后L02細胞形態(tài)的改變。
　　3.流式

4、細胞術(shù)檢測熒光探針標(biāo)記的ROS水平
　　以2，7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)作為熒光探針，采用流式細胞檢測技術(shù)檢測不同劑量的Nano-TiO2處理L02細胞6h、24h后細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量。
　　4.彗星試驗檢測DNA損傷
　　應(yīng)用彗星試驗檢測L02細胞DNA損傷程度。
　　5.宿主細胞恢復(fù)活性實驗(HCR)檢測細胞修復(fù)能力
　　氯化鎘(2μ mol/L)常溫損傷pGL3-Contro

5、l質(zhì)粒2小時，乙醇沉降法回收受損質(zhì)粒，TE溶解沉淀，質(zhì)粒濃度定容為1μg/μl。瞬時轉(zhuǎn)染受損質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒，以不同濃度的Nano-TiO2處理L02細胞24小時后，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測樣品中雙熒光素酶的表達情況，以熒光強度/μg蛋白含量分別表示蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的表達量，以蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值來反應(yīng)DNA修復(fù)能力。
　　6.熒光定量PCR檢測FOXO3a、ChK2、GADD45α及XRCC1

6、基因mRNA水平
　　納米二氧化鈦處理細胞后，Trizol提取細胞總RNA，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA，實時熒光定量PCR檢測FOXO3a-ChK2/XRCC1信號通路中FOXO3a、ChK2、GADD45α及XRCC1基因mRNA水平的表達。
　　7.Western blot檢測FOXO3a、 ChK2、GADD45α及XRCC1蛋白表達水平
　　納米二氧化鈦處理細胞后收獲

7、，RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白，采用Western blot方法檢測FOXO3a-ChK2/XRCC1信號通路中FOXO3a、ChK2、GADD45α及XRCC1蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　1 Nano-TiO2對L02細胞形態(tài)的改變
　　倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):正常培養(yǎng)的L02細胞為菱形，貼壁緊密生長，折光率高。染毒處理后，部分細胞皺縮為圓形，折光率減弱，貼壁能力下降，漂浮于培養(yǎng)液中。
　　2 Nano-T

8、iO2對L02細胞內(nèi)ROS水平的影響
　　隨著Nano-TiO2濃度的增加，ROS水平逐漸升高。當(dāng)Nano-TiO2濃度為0.1μg/mL，染毒6h和24h后，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)Nano-TiO2濃度為1μg/mL、10μg/mL，染毒6h和24h后，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);其中染毒6h后細胞內(nèi)ROS水平高于24h(P＜0.05)。
　　3 Nano-TiO2

9、對L02細胞DNA損傷的影響
　　Nano-TiO2處理細胞以后，各劑量組Olive尾矩增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，并有良好的劑量反應(yīng)關(guān)系(r=0.997，P＜0.05)。
　　4 Nano-TiO2對L02細胞修復(fù)能力的影響
　　隨著Nano-TiO2濃度的增加，蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值逐漸降低，L02細胞對DNA的修復(fù)能力逐漸降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜

10、0.05）。
　　5 Nano-TiO2對L02細胞中FOXO3a、 ChK2、GADD45α基因mRNA水平的表達
　　不同濃度的Nano-TiO2處理L02細胞后，隨著Nano-TiO2濃度的增加，F(xiàn)OXO3a基因mRNA的表達水平呈降低趨勢，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);ChK2基因mRNA的表達水平在1μg/ml和10μg/ml劑量組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);GADD45α基

11、因mRNA的表達降低，其中1μg/ml和10μg/ml劑量組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);XRCC1基因mRNA的表達水平0.1μg/ml劑量組升高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，1μg/ml和10μg/ml劑量組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6 Nano-TiO2對L02細胞中FOXO3a、ChK2、GADD45α、XRCC1蛋白的表達水平
　　L02細胞經(jīng)不

12、同濃度的Nano-TiO2處理后，隨著Nano-TiO2濃度的增加，F(xiàn)OXO3a蛋白的表達降低，其中10μg/ml劑量組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);ChK2蛋白表達水平在0.1μg/ml劑量組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而1μg/ml和10μg/ml劑量組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);GADD45α蛋白的表達顯著降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);XRCC1蛋白

13、表達在1μg/ml、10μg/ml劑量組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1納米二氧化鈦作用于L02細胞時，可以使細胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)氧化損傷。
　　2納米二氧化鈦可以誘導(dǎo)L02細胞發(fā)生DNA損傷并影響細胞對DNA損傷的修復(fù)能力。
　　3納米二氧化鈦染毒后，抑制了氧化應(yīng)激因子FOXO3a和生長阻滯與DNA損傷誘生蛋白45(GADD45α)的表達，抑制FOXO3a的抗氧化作