四君子湯防治D—半乳糖所致小鼠腦細(xì)胞線粒體損傷機(jī)理研究.pdf

1、1選題思路和研究目的隨著人口老齡化的日益明顯，如何延緩衰老，提高年老者的生活質(zhì)量，已成為醫(yī)學(xué)界研究的重大課題。近年來(lái)，中醫(yī)藥以“腎為先天之本”理論為指導(dǎo)，開(kāi)展了大量研究工作，闡明了一些中醫(yī)藥抗衰老的機(jī)理。然而，衰老是一個(gè)多因素綜合作用的復(fù)雜過(guò)程，其中脾作為“后天之本”對(duì)衰老過(guò)程的影響亦不容忽視。 中醫(yī)學(xué)對(duì)衰老的認(rèn)識(shí)，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時(shí)代就已有概說(shuō)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》對(duì)于人進(jìn)入一定年齡階段將必然衰老的原因和衰老發(fā)生機(jī)制，有較為全面的論述

2、?！秲?nèi)經(jīng)》提出：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長(zhǎng)?！迤?，陽(yáng)明脈衰，面始焦，發(fā)始?jí)嫛！煞虬藲q，腎氣實(shí)，發(fā)長(zhǎng)齒更?！税?，則齒發(fā)去。腎主水，受五臟六腑之精而藏之，故五臟盛乃能瀉。今五臟皆衰，筋骨懈墜，天癸盡矣，故發(fā)鬢白，身體重，形步不正，而無(wú)子耳?！?《素問(wèn)·上古天真論》)“人生十歲，五臟始定血?dú)庖淹?，其氣在下，故好走?！呤畾q，脾氣虛，皮膚枯；……百歲，五藏皆虛，神氣皆去，形骸獨(dú)居而終矣”。(《靈樞·天年》)等觀點(diǎn)，明確認(rèn)為，衰老

3、將隨增齡而必然發(fā)生，隨增齡而自發(fā)的臟腑氣血的生理病理變化為衰老的內(nèi)在原因。 脾胃虛損與衰老相關(guān)的學(xué)說(shuō)源于《內(nèi)經(jīng)》，唐、宋、元、明、清諸醫(yī)家，均對(duì)其有所發(fā)展。著名的補(bǔ)土學(xué)家李東垣將其重視脾胃的學(xué)術(shù)思想亦貫入到抗老延年的觀點(diǎn)中，曰：“凡有此(脾胃)病者，雖不易變生他疾，已損天年”，并主張“調(diào)理脾胃，老年當(dāng)先”(《脾胃論》)。李中梓則提出了“先天之本在腎，后天之本在脾”的觀點(diǎn)。張介賓曰：脾腎“皆為五臟六腑之本”，“土為萬(wàn)物之源，胃氣為

4、養(yǎng)生之本……是以養(yǎng)生家必以脾胃為先……善養(yǎng)脾胃之道，所以便能致壽”(《景岳全書》)。吳昆曰：“諸臟腑百骸皆受氣于脾胃，而后能強(qiáng)，若脾胃一虧，則眾體皆無(wú)以受氣，日見(jiàn)蔽弱矣.”(《醫(yī)方考》)。龔?fù)①t曰：“凡年老之人，當(dāng)以養(yǎng)元?dú)猓∑⑽笧橹鳌?《衰老論)。王文祿曰：“是以養(yǎng)脾者……養(yǎng)生之要也?！?《醫(yī)先》)等等?？傊⑽甘艿搅似毡樾缘母叨戎匾?，并把這一重視脾胃的思想極大地貫入到抗老延年的理論指導(dǎo)和治法方藥之中，并以之與補(bǔ)腎抗衰老相提并論，視

5、之為抗衰老的兩大最重要原則。 現(xiàn)代研究表明，健脾法可通過(guò)不同環(huán)節(jié)對(duì)抗機(jī)體的衰老，其延緩衰老作用值得進(jìn)一步探討。本課題以健脾益氣代表方四君子湯為研究手段，觀察其對(duì)衰老小鼠模型mtDNA缺失的影響，以期從基因水平探討脾與衰老的關(guān)系，闡明健脾益氣法延緩衰老的分子作用機(jī)制。研究結(jié)果將豐富中醫(yī)“脾胃學(xué)說(shuō)”理論的內(nèi)涵，為延緩衰老提供新的思路和理論依據(jù)，并為開(kāi)發(fā)研制抗衰老新藥奠定理論基礎(chǔ)。 2研究方法21小鼠衰老模型的建立選用2月齡昆

6、明種小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，維生素E(250mg·kg-1·d-1)組，四君子湯高(20g·kg-1·d-1)、中(10g·kg-1·d-1)、低劑量(5g·kg-1·d-1)組。D-半乳糖亞急性衰老模型，水迷宮測(cè)試確定學(xué)習(xí)記憶障礙模型成立。 22觀測(cè)指標(biāo)221小鼠行為學(xué)觀測(cè)一般狀況觀察及小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力測(cè)試，造模前后各進(jìn)行一次。 222小鼠腦組織NO和NOS含量的測(cè)定硝酸還原酶法測(cè)定NO含量；根據(jù)標(biāo)

7、準(zhǔn)品吸光值，計(jì)算NOS活性。 223谷光甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性測(cè)定黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，DTNB顯色法測(cè)定GSH-Px。 224琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase，SDH)比活性測(cè)定按試劑盒說(shuō)明操作。 225小鼠海馬組織線粒體DNA缺失的測(cè)定PCR擴(kuò)增法。 226Fura-2/AM雙波長(zhǎng)熒光法測(cè)定小鼠海馬鈣濃度熒光分光光度計(jì)測(cè)定。 227透射電鏡樣品制備

8、及觀察透射電鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變并攝片。 228腦細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法流式細(xì)胞儀檢測(cè)法。 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果31一般情況觀察模型組小鼠大多數(shù)表現(xiàn)為毛發(fā)無(wú)光或脫落、精神萎靡、進(jìn)食減少、行動(dòng)遲緩、活動(dòng)減少；部分小鼠可出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、自發(fā)運(yùn)動(dòng)增多或自我嘶咬等癥狀。藥物治療組小鼠也可在造模1個(gè)月左右表現(xiàn)為與模型組類似的癥狀，但癥狀較輕，且這些癥狀在2月內(nèi)逐漸減輕?？瞻讓?duì)照組小鼠均未出現(xiàn)上述類似癥狀。 32四君子湯對(duì)D-半乳糖誘致

9、小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用D-半乳糖處理8周時(shí)，模型組小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯減弱，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶階段的游完全程時(shí)間明顯延長(zhǎng)，進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加，與正常對(duì)照組小鼠比較具有明顯差異(P＜0.01)，而四君子湯高劑量(SG)、中劑量(SZ)、低劑量(SD)及維生素E處理后，明顯縮短模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶階段游完全程時(shí)間和減少進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)(P＜0.01，P＜0.05)。 33四君子湯對(duì)D-半乳糖誘致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦組織NO

10、含量和NOS活性的影響D-半乳糖處理8周時(shí)，模型組小鼠腦組織中NO含量及NOS活性明顯高于正常對(duì)照組小鼠(P＜0.01)，而四君子湯高劑量(SG)、中劑量(SZ)、低劑量(SD)及維生素E處理后，模型小鼠腦組織中NO含量和NOS明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。 34四君子湯對(duì)D-半乳糖誘致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦內(nèi)GSH-Px和SDH活性的影響D-半乳糖處理8周時(shí)，模型組小鼠腦組織中GSH-Px和SDH活力明顯低于正常對(duì)照組小

11、鼠(P＜0.01)，而SG、SZ、SD及維生素E處理后，模型小鼠腦組織中GSH-Px和SDH活力明顯升高(P＜0.01，(P＜0.05)。 35四君子湯對(duì)D-半乳糖誘致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響與對(duì)照組比較，模型(M)組小鼠腦組織中Ca2+活力均顯著增加(P＜0.01)。與M組比較，給予高、中、低劑量的四君子湯和VitE灌胃6周后，SG、SZ、SD組小鼠腦組織中Ca2+活力均明顯降低(P＜0.01)。

12、 36四君子湯對(duì)小鼠腦海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷時(shí)DNA突變的影響所有海馬標(biāo)本均可見(jiàn)0.47kb片斷的一個(gè)條帶，其中模型組小鼠擴(kuò)增出另一個(gè)約0.63kb片斷的條帶(FigA)。說(shuō)明模型組小鼠海馬mtDNA中存在著約3.87kb片斷缺失。 37電鏡正常組海馬神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常。 模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)疏松，胞漿電子密度增高，核仁仍清晰，大部分細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清，脂褐素沉積增多，線粒體數(shù)目減少、線粒體腫脹，基質(zhì)清淡、有空泡化，甚至見(jiàn)

13、大量線粒體嵴呈畸形樣變或缺失 給藥組海馬神經(jīng)細(xì)胞輪廓清晰，胞膜完整，雙層結(jié)構(gòu)清晰，線粒體大量分布，形態(tài)規(guī)則，線粒體嵴清晰，胞質(zhì)中除見(jiàn)核糖體增多外，均接近正常組 4結(jié)論不同劑量的四君子湯水提物均能有效干預(yù)腦的老化，不同程度的減輕腦海馬組織線粒體DNA的缺失，改善學(xué)習(xí)記憶能力。四君子湯干預(yù)腦老化的作用機(jī)制可能是：SJZ能提高抗氧化能力，調(diào)節(jié)機(jī)體氧化損傷與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調(diào)；降低鈣離子濃度，減少NOS的激活，阻止NO過(guò)量

14、生成，減輕自由基對(duì)神經(jīng)元的損傷，減少mtDNA缺失，改善線粒體能量代謝障礙，維護(hù)線粒體功能。由此推測(cè)，四君子湯可能通過(guò)多途徑、多環(huán)節(jié)，作用于多個(gè)靶點(diǎn)，而發(fā)揮其抗衰老的作用。 創(chuàng)新之處：本實(shí)驗(yàn)所選tmRNA、GSH-Px等作為觀察指標(biāo)，從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)以及基因水平進(jìn)行研究，技術(shù)層面新穎、完整，有一定的先進(jìn)性。在理論方面，本研究從基因水平探求“脾虛衰老”理論的物質(zhì)基礎(chǔ)，為補(bǔ)脾抗衰老提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步豐富了“脾虛衰老”理論的內(nèi)涵。

15、 5總結(jié)通過(guò)對(duì)古今中醫(yī)衰老機(jī)理的理論及實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)資料的綜合、分析，本實(shí)驗(yàn)基于《內(nèi)經(jīng)》和后世醫(yī)家對(duì)脾胃與衰老關(guān)系的認(rèn)識(shí)，并結(jié)合現(xiàn)代人類生活方式的現(xiàn)狀，尤其是不健康飲食習(xí)慣影響脾胃功能、影響體內(nèi)代謝，加速衰老的可能性，以健脾益氣代表方四君子湯為研究手段，以期從基因水平以及多個(gè)技術(shù)層面探討脾與衰老的關(guān)系，闡明健脾益氣法延緩衰老的分子作用機(jī)制。 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，健脾益氣的手段確有干預(yù)腦的老化，減輕腦海馬組織線粒體DNA的缺失，改

16、善學(xué)習(xí)記憶的能力。也就是說(shuō)，有一定程度的抗衰老作用。由此可以進(jìn)一步說(shuō)明脾胃和衰老的關(guān)系不容忽視。 結(jié)合目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題下一步的研究可以從一下幾方面進(jìn)行：①可對(duì)四君子湯進(jìn)行拆方研究，以進(jìn)一步確認(rèn)延緩衰老的最佳配伍關(guān)系(有效單味藥或有效部位群)，為開(kāi)發(fā)研制抗衰老新藥奠定基礎(chǔ)。此外，四君子湯改善衰老模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的物質(zhì)基礎(chǔ)有待于深入研究。由于影響衰老的因素眾多，本實(shí)驗(yàn)僅從幾方面進(jìn)行了觀察，相關(guān)進(jìn)一步研究有待開(kāi)展。②用脾