熱休克蛋白對過氧化氫所致心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、該研究采用0.5mmol/L過氧化氫(hydrogen peroxide,H<,2>O<,2>)分別作用于原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞和C<,2>C<,12>細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,探討膜死亡受體通路和線粒體通路在其中的作用.在此基礎(chǔ)上,通過熱休克誘導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染增加細(xì)胞中熱休克蛋白的表達(dá),觀察熱休克蛋白對過氧化氫所致細(xì)胞凋亡的抑制作用并探討其與上述兩條信號通路的關(guān)系.主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、H<,2>O<,2>誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和C<,2>C<,12

2、>細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.經(jīng)原位缺口末端標(biāo)記和Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn),暴露于0.5mmol/L H<,2>O<,2> 24h后,心肌細(xì)胞和C<,2>C<,12>細(xì)胞均出現(xiàn)明顯凋亡;Caspase活性定量檢測和Western-blot顯示,H<,2>O<,2>處理4h后,心肌細(xì)胞和C<,2>C<,12>細(xì)胞中Caspase-3,8,9的活性均明顯增高;通過差速離心法分離胞漿和線粒體成分后作Western-blot檢測,以及通過間接

3、免疫熒光觀察,發(fā)現(xiàn)H<,2>O<,2>處理心肌細(xì)胞和C<,2>C<,12>細(xì)胞2h后,細(xì)胞色細(xì)胞內(nèi)Bid大量裂解成tBid.2、熱休克反應(yīng)抑制H<,2>O<,2>所致心肌細(xì)胞和C<,2>C<,12>細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.Western-blot顯示心肌細(xì)胞和C<,2>C<,12>細(xì)胞經(jīng)熱休克反應(yīng)后,HSP70與αB-晶狀體蛋白的表達(dá)明顯增加;經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33258染色檢測發(fā)現(xiàn),熱休克反應(yīng)可顯著減少H<,2>O<,2>所致

4、的細(xì)胞凋亡;Caspase活性定量檢測和Western-blot顯示,當(dāng)細(xì)胞經(jīng)熱休克反應(yīng)后再暴露于H<,2>O<,2>時,各時間點(diǎn)的Caspase-3,8,9活性均明顯低于H<,2>O<,2>損傷組;通過差速離心法分離胞漿和線粒體成分后分別作Western-blot檢測顯示,熱休克反應(yīng)可明顯抑制細(xì)胞色素C從線粒體向胞漿的移位;Western-blot檢測顯示,熱休克反應(yīng)明顯抑制H<,2>O<,2>所致C<,2>C<,12>肌原細(xì)胞中的B

5、id裂解成tBid.3、HSP70抑制H<,2>O<,2>所致C<,2>C<,12>肌原細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.構(gòu)建pcDNA3.1-HSP70重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HSP70及對照質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染C<,2>C<,12>肌原細(xì)胞36h,經(jīng)Western-blot分析證明轉(zhuǎn)HSP70基因可明顯增加細(xì)胞內(nèi)HSP70蛋白的表達(dá);Hoechst 33258染色后計(jì)數(shù)凋亡核百分率以及DNA"梯狀"條帶檢測均顯示,HSP70

6、過表達(dá)可抑制H<,2>O<,2>所致的C<,2>C<,12>肌原細(xì)胞凋亡;經(jīng)Western-blot分析證明,HSP70過表達(dá)可明顯抑制H<,2>O<,2>所致的Caspase-3,8,9活化和Bid裂解成tBid.綜上所述,在H<,2>O<,2>所致的心肌細(xì)胞和C<,2>C<,12>細(xì)胞凋亡中,膜死亡受體通路和線粒體通路均發(fā)揮了重要作用,兩條通路又通過tBid進(jìn)行溝通.熱休克反應(yīng)以及HSP70通過干預(yù)上述兩條通路而抑制H<,2>O<,