過氧化氫誘導雞心肌細胞凋亡的轉錄組學研究.pdf

1、細胞凋亡指由基因控制的細胞自主有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達和調控的改變。心肌細胞是終末分化細胞，增殖能力極弱，在胚胎期后期，其數(shù)量就幾乎不再增長。凋亡和壞死是心肌細胞數(shù)量減少的最主要原因，心肌數(shù)量減少后難以恢復，進而逐步降低心肌細胞的功能，形成心衰等癥狀。雞的不少疾病病程中也伴隨著明顯的心肌細胞凋亡和損傷，心肌細胞的凋亡甚至成為某些疾病的始動因素，如腹水綜合征等疾病。因此，凋亡在雞心肌細胞中占有非常重要的地位。
　　轉

2、錄組測序可以將特定細胞在某一狀態(tài)下所能轉錄出來的所有RNA，包括mRNA和非編碼RNA全部高通量測序。它是基因功能及結構研究的基礎和出發(fā)點，通過新一代高通量測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本序列信息，并忠實反映出細胞內所有基因表達的變化。
　　目前，哺乳動物心肌細胞凋亡的研究已經(jīng)比較充分，近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了越來越多的凋亡或凋亡阻抑分子，發(fā)掘了大量的凋亡信號通路，其作用機理也研究得比較充分。但

3、雞心肌細胞凋亡的相關研究開展較少，其很多重要分子沒有被發(fā)現(xiàn)，凋亡通路也沒有完善，其具體的凋亡和凋亡阻抑也不能直接套用哺乳動物的研究結果。根據(jù)轉錄組測序技術的特性，將可以一站式的解決這些問題。
　　為了補充上述雞心肌細胞凋亡研究方面的不足，理清雞心肌細胞凋亡中的各個環(huán)節(jié)，找出其具體的凋亡通路，構建凋亡的蛋白互作網(wǎng)絡，開展了以下的試驗研究:
　　1.雞心肌原代細胞培養(yǎng)鑒定與凋亡誘導試驗
　　為建立雞心肌原代細胞培養(yǎng)模型和獲

4、得穩(wěn)定、高純度的雞心肌原代細胞，并初步探討凋亡誘導條件，采用14d白來航雞胚，細致分離其心室肌，剪碎，0.05％胰酶消化，吹打，離心收獲細胞，接種于T25細胞培養(yǎng)瓶，30min差速貼壁轉接24孔板，6h后洗滌1次，培養(yǎng)的細胞進行形態(tài)學觀察、免疫組化檢測鑒定和肌球蛋白PCR鑒定。獲得的細胞用0.1-1.6 mM梯度過氧化氫誘導凋亡，檢測凋亡出現(xiàn)的時間和凋亡基因表達的變化，結果顯示胰酶消化法可以獲得很高純度的心肌細胞，細胞呈大三角形，持續(xù)培

5、養(yǎng)下具有多形性。a-actin免疫組化鑒定為陽性，肌球蛋白PCR鑒定陽性，細胞可以穩(wěn)定生長15天以上。在0.2mM過氧化氫誘導下，經(jīng)過9h，雞心肌原代細胞發(fā)生明顯細胞凋亡，凋亡相關基因的表達達到峰值，可用于后期凋亡誘導試驗。
　　2.轉錄組測序鑒定過氧化氫誘導的雞心肌細胞凋亡應答
　　為了解雞心肌細胞凋亡下各種應答、建立凋亡相關通路，培養(yǎng)雞心肌原代細胞，誘導心肌細胞凋亡，提取RNA并進行該心肌細胞全轉錄本測序，并與正常組進行

6、對比。通過RNAseq，我們總共發(fā)現(xiàn)19268個轉錄本和2160個新基因，而在凋亡進程中，總共有6148基因發(fā)生明顯差異表達，其中14.5％的表達上調和17.5％的表達下調。通過對測序分析，總共富集了152條信號通路，其中，絕對多數(shù)是合成和代謝相關的通路，但也有一些直接是凋亡信號通路。合成和代謝相關的通路主要包括:“脂肪酸代謝”、“丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸的代謝”、“不飽和脂肪酸生物合成”、“內質網(wǎng)蛋白加工”等，和凋亡直接相關的信號通

7、路的激活主要包括:“PPAR信號通路”、“脂肪細胞因子信號通路”、“TGF-beta信號通路”、“Toll樣受體信號通路”、“MAPK信號通路”、“p53信號通路”和“Wnt信號通路”。除了這兩大類通路以外，我們發(fā)現(xiàn)，其他一些通路也明顯被激活，如“Regulation of actin cytoskeleton”和“cell cycle”。從通路篩選的情況來看，過氧化氫誘導不僅僅形成了凋亡，而且過氧化氫的細胞毒性也明顯影響了細胞的各種功