基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的陽春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的挖掘.pdf

1、目的:
　　通過對陽春砂轉(zhuǎn)錄組及表達譜數(shù)據(jù)深入研究，挖掘揮發(fā)性萜類合酶相關基因，并對其基因表達特性及功能進行研究，為深入認識陽春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑和分子調(diào)控機制奠定基礎，為推進陽春砂萜類活性成分的代謝工程調(diào)控及種質(zhì)資源優(yōu)化提供幫助。
　　方法:
　　通過對陽春砂果實不同成熟時期及MeJA誘導實驗2個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中KEGGpathway注釋情況進行篩選并統(tǒng)計，并結(jié)合陽春砂中含有的主要揮發(fā)性萜類成分及其在單萜、倍半萜類化合

2、物生物合成途徑中的相關酶基因，在NCBI中查找并下載龍腦基二磷酸合酶、蒎烯合酶、松油烯合酶等4個單萜合酶與雙環(huán)大根香葉烯合酶等5個倍半萜合酶的其他物種中相應基因的蛋白序列，通過本地BLAST軟件對陽春砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行blastp、tblastn比對再注釋，獲取更多候選unigene，再通過同源進化分析、轉(zhuǎn)錄組間關聯(lián)比對等方法最終篩選出陽春砂揮發(fā)性萜類合酶候選基因(AvTPS)。
　　對候選AvTPS基因進行開放閱讀框（ORF）預測

3、，并對含有全長ORF的AvTPS基因設計引物，擴增其編碼區(qū)全長DNA，通過平末端連接的方法構建目的AvTPS基因的克隆載體;并通過生物信息學分析，推測這些基因的開放閱讀框、編碼氨基酸、編碼蛋白分子質(zhì)量、等電點、親疏水性等理化性質(zhì)，預測亞細胞定位及一二級結(jié)構，并通過與已知TPS的多序列比對及遺傳進化分析推測其功能。
　　通過絕對定量法對克隆所得AvTPS基因進行實時熒光定量PCR檢測，分析其在陽春砂不同部位及不同成熟時期的表達水平變

4、化;并通過MeJA誘導實驗中AvTPS基因表達譜數(shù)據(jù)及揮發(fā)性萜類含量數(shù)據(jù)進行兩兩線性相關系數(shù)的計算，分析AvTPS基因與陽春砂揮發(fā)性萜類成分的相關性。
　　結(jié)果:
　　3.1 陽春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的挖掘
　　本文從2個陽春砂轉(zhuǎn)錄組中共篩選獲得揮發(fā)性萜類合成下游途徑相關unigene27個，包括轉(zhuǎn)錄組直接注釋unigene9個，本地blast再注釋unigene18個;并結(jié)合與NCBIblastp所得相似序列的同源進

5、化分析、轉(zhuǎn)錄組間unigene的序列相似性分析，最終選定11個陽春砂揮發(fā)性萜類合酶候選基因，重命名為AvTPS1～11。
　　3.2 AvTPS編碼區(qū)全長序列的克隆及其編碼蛋白功能分析
　　對有全長ORF的4個AvTPS編碼區(qū)全長進行了克隆，AvTPS1包含1803bp的ORF，編碼600個氨基酸;AvTPS3包含1791bp的ORF，編碼597個氨基酸;AvTPS5包含888bp的ORF，編碼295個氨基酸;AvTPS8包

6、含1650bp的ORF，編碼549個氨基酸;并成功構建其重組克隆載體pLB-AvTPS1、pLB-AvTPS3、pLB-AvTPS5和pLB-AvTPS8。除AvTPS5外，其他3個AvTPS預測蛋白分子量均在60～70kDa之間、等電點接近5.0、pH接近中性，與其他已知TPS相似;結(jié)構上也具有DDXXD等TPS特征功能域，與其他已知TPS也表現(xiàn)出較近的遺傳距離，將AvTPS1和AvTPS3歸類于單萜合酶，AvTPS8歸類于倍半萜合酶

7、。AvTPS5編碼蛋白各性質(zhì)則更接近于萜類環(huán)化下一階段的脫氫還原酶。
　　3.3 AvTPS基因的表達變化及相關性分析
　　本研究對克隆所得4個AvTPS基因進行了qRT-qPCR表達水平檢測，結(jié)果表明AvTPS1、AvTPS3和AvTPS8表現(xiàn)出顯著的組織特異性，AvTPS1、AvTPS3和AvTPS5則表現(xiàn)出了生長發(fā)育階段的表達特異性，符合萜類合酶表達與調(diào)控的時空差異的特點。進一步將各AvTPS的表達量數(shù)據(jù)與陽春砂揮發(fā)性

8、萜類數(shù)據(jù)關聯(lián)分析，證明大部分AvTPS均與陽春砂中的揮發(fā)性萜類化合物含量總量呈現(xiàn)出一定的相關性，AvTPS2、AvTPS5、AvTPS7和AvTPS9表現(xiàn)出較一致的相關模式， AvTPS6和AvTPS11則往往表現(xiàn)出另一類相反的相關模式;且根據(jù)與具體萜類化合物含量的關聯(lián)分析，在果皮中表達較高的AvTPS1、AvTPS2等及在種子團中表達較高的AvTPS3、AvTPS6等分別與不同部位的主要成分分別呈正相關，可能在這些物質(zhì)的合成途徑中起到