基于RNA-Seq的陽春砂JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及萜類合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究.pdf

1、陽春砂是一種重要的南藥之一，其藥用成分以揮發(fā)油為主，包括α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、檸檬烯、香葉烯、芳樟醇、石竹烯、乙酸龍腦酯等揮發(fā)性萜類成分。植物體內(nèi)揮發(fā)性萜類的合成主要由萜類合酶完成。萜類生物合成途徑階段Ⅰ中合成萜類骨架的關(guān)鍵酶已比較清楚，但對(duì)揮發(fā)性萜類的合成起到直接環(huán)化和修飾作用的是階段Ⅱ、Ⅲ的萜類合酶（即下游萜類合酶），現(xiàn)在關(guān)于下游萜類合酶的研究甚少。轉(zhuǎn)錄因子是指與靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合，調(diào)控下游功能基因表達(dá)的一類結(jié)合蛋白。獲

2、得調(diào)控相關(guān)萜類合酶基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子能為有效地提高陽春砂揮發(fā)性萜類成分的含量提供研究靶點(diǎn)。
　　目的:
　　轉(zhuǎn)錄因子具有“多點(diǎn)調(diào)控”的優(yōu)勢(shì)，作為上游的調(diào)控元件，既能調(diào)控植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平，又能調(diào)控萜類合成，應(yīng)用基因工程改造轉(zhuǎn)錄因子從而定向調(diào)控次生代謝物積累具有良好的發(fā)展前景。然而，現(xiàn)有研究中有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究仍有諸多空白。因此，本論文擬深入分析茉莉酸甲酯(Methylj asmonate，MeJA)誘導(dǎo)陽春砂果實(shí)

3、中參與茉莉酸(Jasmonate，JA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及萜類合成途徑的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，旨在全面認(rèn)識(shí)陽春砂轉(zhuǎn)錄因子在萜類生物合成途徑中的調(diào)控過程，為利用基因工程改造陽春砂，定向增加陽春砂揮發(fā)性萜類的產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)，促進(jìn)中藥種質(zhì)生物化學(xué)的研究及基于轉(zhuǎn)錄因子的代謝工程研究。
　　方法:
　　2.1 陽春砂轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)萜類合酶基因的挖掘
　　利用MeJA誘導(dǎo)的陽春砂轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù)，以本地blast及注釋方法篩選差異表達(dá)轉(zhuǎn)

4、錄因子基因。再上呈所篩選的轉(zhuǎn)錄因子蛋白至NCBI CDD和Plant TFcat服務(wù)器進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)方法篩選共表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子及萜類合酶基因(unigene)。最后，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與次生代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)構(gòu)建權(quán)重網(wǎng)絡(luò)分析模型，挖掘出與萜類相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及萜類合酶基因。
　　2.2 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
　　提取陽春砂果實(shí)的果皮及種子團(tuán)部位的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)候選基因(unigen

5、e)的序列設(shè)計(jì)引物并驗(yàn)證引物的有效性，篩選最佳退火溫度。通過擴(kuò)增效率、標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)引物對(duì)進(jìn)行評(píng)估，若有需要?jiǎng)t重新設(shè)計(jì)引物。最后，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定候選基因的Cq值并以2-ΔΔCT計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。
　　2.3 高濃度茉莉酸甲酯噴施陽春砂
　　將成熟期長(zhǎng)勢(shì)相近的果實(shí)的陽春砂植株隨機(jī)分為溶劑組、MeJA噴施果實(shí)組，分別噴施含0.0001％吐溫-80純水的溶劑、600μmol·L-1 MeJA和1000μm

6、ol·L-1MeJA于陽春砂果實(shí)中，同時(shí)設(shè)空白組（不作任何處理），噴施后24h采集。
　　2.4 MeJA誘導(dǎo)的陽春砂果實(shí)內(nèi)源茉莉酸含量的分析
　　陽春砂樣品粉末進(jìn)行高效提取，減壓濃縮后利用固相萃取進(jìn)行富集，減壓濃縮后以甲醇溶解，利用LC/MS測(cè)定樣品中JA含量。
　　2.5 候選轉(zhuǎn)錄因子的生物信息分析
　　以SubLoc、PSORT、TargetP預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位和核定位信號(hào)肽。以擬南芥基因組作參考，利

7、用planttfdb數(shù)據(jù)庫查找目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子相似度最佳的序列并搜索其對(duì)應(yīng)的相互作用蛋白。使用JASPAR2016 server預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因結(jié)合位點(diǎn)信息。最后，利用ORFfinder分析目標(biāo)基因序列是否含有完整的開放閱讀框。
　　結(jié)果:
　　3.1 MeJA誘導(dǎo)差異表達(dá)的WRKY及相關(guān)萜類合酶基因的分析
　　本論文利用MeJA誘導(dǎo)的陽春砂果實(shí)RNA-Seq數(shù)據(jù)篩選出36條包含WRKY保守域的轉(zhuǎn)錄因子。通過多種生物信

8、息學(xué)分析，獲得6個(gè)差異表達(dá)的WRKY基因(AvWRKY6、AvWRKY21、AvWRKY28、AvWRKY40、AvWRKY72和AvWRKY75)，及其相關(guān)的4個(gè)萜類合酶候選基因((+)-新薄荷醇脫氫酶、S-(+)-芳樟醇合酶、(+)-大根香葉烯D合酶和月桂烯合酶基因）作為萜類合成相關(guān)的候選基因。對(duì)候選基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證并預(yù)測(cè)AvWRKY40、AvWRKY28和AvWRKY72可能協(xié)同調(diào)控(+)-新薄荷醇脫氫酶基因（AvNeo

9、D）的表達(dá)，影響單萜類合成。
　　3.2 MeJA誘導(dǎo)差異表達(dá)的MYC及相關(guān)萜類合酶基因的分析
　　我們利用生物信息學(xué)方法篩選出5個(gè)與萜類合成相關(guān)的MYC基因（AvMYC4a、AvMYC4b、AvMYC2a、AvMYC2b和AvMYC4c）和5個(gè)萜類合酶基因（β-桉葉醇合酶、倍半萜類合酶3、倍半萜類合酶A1、大根香葉烯D合酶和芳樟醇合酶基因）。利用生物信息學(xué)方法結(jié)合轉(zhuǎn)錄組及代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)獲得與萜類合成相關(guān)的AvMYC4a、Av

10、MYC4b、AvMYC2b、β-桉葉醇合酶基因(AvEud)和大根香葉烯D合酶(AvGerD)基因。通過RT-qPCR數(shù)據(jù)構(gòu)建調(diào)控模型，預(yù)測(cè)AvMYC4a、AvMYC4b可能沒有直接調(diào)控AvEud基因，但AvMYC4a可能通過激活其他萜類合酶的啟動(dòng)子調(diào)控單萜類化合物合成。
　　3.3 MeJA誘導(dǎo)對(duì)陽春砂內(nèi)源JA及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的影響
　　陽春砂果皮和種子團(tuán)內(nèi)源JA含量變化趨于一致。JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在轉(zhuǎn)錄水平存在空間差異性，

11、且不同濃度MeJA響應(yīng)效率也存在差異。200μmol·L-1MeJA更能誘導(dǎo)JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)。陽春砂與其他植物內(nèi)JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄方式具有同一性，但植物物種間局部基因具有多樣性。根據(jù)JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推測(cè)MeJA可能誘導(dǎo)陽春砂果實(shí)內(nèi)AvJAR1表達(dá)，募集AvJAZ1b蛋白，AvJAZ1b與AvJAZ1a相互作用后釋放出AvMYC2b，調(diào)控下游基因的表達(dá)。
　　3.4 高濃度MeJA誘導(dǎo)陽春砂候選基因的表達(dá)變化
　　

12、前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MeJA處理組揮發(fā)性萜類含量比溶劑組低，這可能由于溶劑濃度過高而致。600μmol·L-1MeJA比200μmol·L-1 MeJA誘導(dǎo)揮發(fā)性萜類的效率更高，推測(cè)高濃度MeJA更能誘導(dǎo)揮發(fā)性萜類的合成。因此，以0.0001％吐溫-80作為溶劑，600μmol·L-1及1000μmol·L-1 MeJA處理陽春砂果實(shí)發(fā)現(xiàn)陽春砂果實(shí)內(nèi)源JA均隨著MeJA濃度升高而增加。陽春砂果皮及種子團(tuán)內(nèi)源含量變化一致。AvMYC2b及AvNe

13、oD響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)，但兩者對(duì)MeJA的敏感度有所差異。AvMYC2b的表達(dá)量變化與內(nèi)源JA含量變化高度一致，AvMYC2b是JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心元件，由此推測(cè)果實(shí)內(nèi)源JA的含量影響JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蚬脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)AvWRKY28與AvWRKY6協(xié)同調(diào)控AvNeoD的表達(dá)。AvMYC4a、AvMYC4b和AvWRKY72可能形成蛋白復(fù)合物進(jìn)而激活A(yù)vEud的啟動(dòng)子調(diào)控相應(yīng)的揮發(fā)性萜類合成。
　　3.5 萜類合成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初

14、步構(gòu)建及關(guān)鍵基因生物信息學(xué)分析
　　脫氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，MEP)和甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑的關(guān)鍵萜類合酶基因的轉(zhuǎn)錄水平具有空間差異性，不同基因相應(yīng)MeJA的濃度不一。從萜類合成關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型中可推測(cè)MeJA誘導(dǎo)陽春砂果實(shí)內(nèi)JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激發(fā)AvMYCs調(diào)控萜類合酶的表達(dá)，影響單萜類成分合成。AvWRKY6、AvWRKY28、AvWRKY72

15、、AvWRKY40可能主要調(diào)控單萜化合物的合成。AvWRKY75可能主要調(diào)控倍半萜類化合物的合成。AvWRKY40、AvWRKY72、AvWRKY28、Av WRK Y6、AvWRKY75和AvMYC2b可能均定位于細(xì)胞核中。除AvWRKY28和AvWRKY72外，上述候選轉(zhuǎn)錄因子均可能與其他因子互作。上述候選轉(zhuǎn)錄因子均沒有完整全長(zhǎng)，后續(xù)可根據(jù)上述信息設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　結(jié)論:
　　本論文以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合代謝組數(shù)據(jù)獲