TNF-α對膽囊癌VEGF-C表達(dá)及淋巴管生成的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：TNF-α是介導(dǎo)膽囊慢性炎癥的重要細(xì)胞因子之一，而膽囊慢性炎癥又是膽囊癌的主要危險(xiǎn)因素之一。已有研究表明TNF-α可能與膽囊癌的進(jìn)展有關(guān)，但具體機(jī)制不明。有報(bào)道稱TNF-α在纖維母細(xì)胞及風(fēng)濕病滑膜細(xì)胞中可促進(jìn)VEGF-C的表達(dá)，而VEGF-C在膽囊癌中是一種重要的淋巴生成因子。本課題將研究TNF-α能否在體內(nèi)外通過上調(diào)VEGF-C的表達(dá)來促進(jìn)膽囊癌微淋巴管生成，并進(jìn)一步探討其分子機(jī)制。
　　方法：通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELI

2、SA)及免疫組化法檢測、分析膽囊癌膽汁標(biāo)本中TNF-α、VEGF-C及組織標(biāo)本淋巴管密度（LVD）之間的相關(guān)性；Real-time PCR及ELSIA法檢測TNF-α對膽囊癌細(xì)胞株NOZ的VEGF-C轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響；建立膽囊癌細(xì)胞 NOZ、人真皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞 HDLECs混合培養(yǎng)系統(tǒng)，通過淋巴小管形成試驗(yàn)觀察TNF-α對淋巴成管的影響；建立裸鼠膽囊癌原位移植模型，制作腫瘤標(biāo)本石蠟切片，免疫組化法檢測TNF-α對淋巴管密度的影響；

3、構(gòu)建VEGF-C啟動子雙熒光報(bào)告系統(tǒng)，通過定點(diǎn)誘變、電泳遷移率變動分析（EMSA）和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)確定啟動子上的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)及TNF-α對啟動子活性的影響。
　　結(jié)果：⑴膽囊癌膽汁標(biāo)本TNF-α濃度（609.0±43.43pg/ml）高于對照組Vs（193.3±13.47pg/ml，P＜0.001）；膽囊癌膽汁標(biāo)本中的TNF-α和VEGF-C呈正相關(guān)（P＜0.01），與膽囊癌組織的LVD亦呈正相關(guān)（P＜0.01

4、）；⑵TNF-α可促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞VEGF-C的mRNA及蛋白表達(dá)，并呈濃度、時間依賴性；⑶體外淋巴小管形成試驗(yàn)中，膽囊癌細(xì)胞與HDLECs混合培養(yǎng)時，TNF-α處理組的小管形成數(shù)目（10.89±1.10）較TNF-α非處理組（6.82±0.62）明顯增加（P＜0.05），小管形成長度（10.26±1.034mm）較非處理組（6.14±0.74mm）增加（P＜0.05），小管形成面積（0.86±0.04mm2）較非處理組（0.65±0.0

5、6mm2）亦增加（P＜0.05）； siRNA干擾VEGF-C基因的膽囊癌細(xì)胞與HDLECs混合培養(yǎng)時，TNF-α處理組的成管數(shù)目（4.11±0.35）較非處理組（3.44±0.29）仍升高（P＜0.05），但其升高幅度（39.27％±5.60%）較對照組（71.14%±5.15%）顯著下降（P＜0.05），成管長度（4.34±0.24mm）與非處理組（3.48±0.43mm）無顯著差異（P＞0.05），成管面積（0.39±0.02mm

6、2）與非處理組（0.33±0.04mm2）亦無顯著差異（P＞0.05）；⑷裸鼠膽囊癌原位移植模型中，TNF-α處理組膽囊癌組織的LVD（14.33±1.17）較非處理組（10.33±1.17）明顯增加（P＜0.05）；在siRNA干擾VEGF-C基因的膽囊癌模型中，TNF-α處理組的淋巴管密度（7.44±0.44）較非處理組（5.89±0.29）仍升高（P＜0.05），但其升高幅度（26.37%±4.85%）較對照組（44.19%±3.