顳葉癲癇大鼠認(rèn)知功能與突觸重塑相關(guān)蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景: 癲癇是嚴(yán)重危害人類健康的慢性腦部疾病之一，癲癇發(fā)作易導(dǎo)致認(rèn)知和行為異常，全世界目前約有5000萬癲癇患者，給社會(huì)、家庭和個(gè)人都帶來了沉重負(fù)擔(dān)。顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy， TLE）是癲癇發(fā)作中最常見的類型，自發(fā)性再發(fā)作（spontaneous recurrent seizure，SRS）是其特征，發(fā)作大多由顳葉及其附近的病變引起，臨床上常表現(xiàn)為感覺、情緒、精神和運(yùn)動(dòng)等各種癥狀。由于顳葉癲癇

2、的發(fā)作與海馬等邊緣系統(tǒng)的病變密切相關(guān)，而海馬等又參與了記憶、學(xué)習(xí)、情緒、行為等認(rèn)知功能的形成，所以，最近有關(guān)顳葉癲癇引起的認(rèn)知功能障礙逐漸受到了人們的重視。認(rèn)知功能是人類和動(dòng)物的大腦高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)，主要包括精神、智力活動(dòng)的各個(gè)方面，如感覺、知覺、學(xué)習(xí)、記憶，其中最主要的是學(xué)習(xí)和記憶。學(xué)習(xí)、記憶的形成是十分復(fù)雜的，最近的研究表明，海馬結(jié)構(gòu)、突觸的可塑性、抑制性氨基酸受體、鈣離子、一氧化氮（nitrogen monoxidum，NO）等參與了

3、學(xué)習(xí)與記憶的過程。一些與突觸重塑相關(guān)的蛋白被認(rèn)為是突觸可塑性的主要調(diào)控者。目前，突觸重塑相關(guān)蛋白在癲癇發(fā)作中的作用與機(jī)制已有少量報(bào)道，但是突觸重塑相關(guān)蛋白在顳葉癲癇認(rèn)知功能障礙中的作用和機(jī)制卻不十分清楚，對(duì)顳葉癲癇認(rèn)知功能障礙的預(yù)防和治療也缺乏有效手段。 第一部分顳葉癲癇大鼠認(rèn)知損害與海馬區(qū)synaptophysin、SNAP-25、synaptotagmin1的異常表達(dá) 目的: 評(píng)價(jià)KA誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型認(rèn)

4、知功能損害；研究Syp、SNAP-25、Syt1在顳葉癲癇認(rèn)知功能障礙大鼠海馬區(qū)的表達(dá)，探討導(dǎo)致顳葉癲癇認(rèn)知功能損害的可能分子機(jī)制。 方法: 1．應(yīng)用腹腔注射系統(tǒng)給藥的方法建立KA誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、KA組，根據(jù)是否發(fā)展為SRS，KA組又分為顳葉癲癇組（KA+SRS組）、非顳葉癲癇組（KA-SRS組）。 2．應(yīng)用行為學(xué)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)各組大鼠在致癇后6周（weeks，w）的認(rèn)知功能。 3．

5、應(yīng)用HE、Nissl染色觀察KA+SRS組、KA-SRS組大鼠在致癇后6w海馬神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目改變。 4．應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色在電鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠在致癇后6w海馬區(qū)Syp、SNAP-25、Syt1的表達(dá)。 5．應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組大鼠在致癇后6w海馬區(qū)Syp、SNAP-25、Syt1mRNA的表達(dá)。 6．應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組大鼠在致癇后6w海馬區(qū)Syp、SNAP-25、Syt1蛋白的表達(dá)

6、。 結(jié)果: 1．Morris水迷宮（Morris water maze）、高架十字迷宮（elevated-plus maze）、開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open field）檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，KA-SRS組大鼠認(rèn)知功能未見明顯區(qū)別，KA+SRS組大鼠認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙（P<0．05）。 2．對(duì)照組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回門區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，未見明顯神經(jīng)元丟失壞

7、死。KA+SRS組大鼠海馬CA1、CA2、CA3、CA4及齒狀回區(qū)未見廣泛神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生，可見局部神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生。KA-SRS組大鼠海馬未見明顯神經(jīng)元丟失。 3．Syp、SNAP-25、Syt1免疫組化研究顯示，對(duì)照組大鼠海馬可見數(shù)目較多、深染的棕褐色Syp、SNAP-25、Syt1陽性神經(jīng)元，與對(duì)照組比較，KA-SRS組無明顯差別，KA+SRS組Syp、SNAP-25陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯較少、染色較淺，Syt1陽性神

8、經(jīng)元數(shù)目明顯增多、染色較深。 4．RT-PCR研究顯示，與對(duì)照組比較，KA-SRS組Syp、SNAP-25、Syt1mRNA表達(dá)無明顯差別，KA+SRS組Syp、SNAP-25 mRNA表達(dá)減弱（P<0．05）、Syt1mRNA表達(dá)無明顯差別。 5．Western blot研究顯示，與對(duì)照組比較，KA-SRS組Syp、SNAP-25、Syt1蛋白表達(dá)無明顯差別，KA+SRS組Syp、SNAP-25蛋白表達(dá)減弱（P<0．0

9、5），Syt1蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P<0．05）。 結(jié)論: 1．顳葉癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可以導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。 2．本實(shí)驗(yàn)中顳葉癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作6w后未見廣泛神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生，可見局部神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生。 3．顳葉癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致Syp、SNAP-25表達(dá)減弱、Syt1表達(dá)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。 第二部分顳葉癲癇大鼠認(rèn)知功能變化與海馬區(qū)NR2B/PSD-95動(dòng)態(tài)表達(dá)的研究 目的:

10、 評(píng)價(jià)KA誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型認(rèn)知功能變化；研究NR2B/PSD-95在顳葉癲癇認(rèn)知功能障礙大鼠海馬區(qū)的動(dòng)態(tài)表達(dá)及抗癲癇藥物丙戊酸鈉（valproic acid，VPA）對(duì)顳葉癲癇認(rèn)知功能及海馬區(qū)NR2B/PSD-95表達(dá)的影響，探討導(dǎo)致顳葉癲癇認(rèn)知功能障礙的可能分子機(jī)制。 方法: 1．應(yīng)用腹腔注射系統(tǒng)給藥的方法建立KA誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、KA組、KA+VPA組，根據(jù)行為學(xué)檢測(cè)時(shí)間，以上三

11、個(gè)組再各自分為2w、4w、6w三個(gè)亞組。 2．應(yīng)用行為學(xué)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)各亞組大鼠認(rèn)知功能的變化。 3．應(yīng)用Nissl染色觀察KA組、KA+VPA組大鼠癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作后6w海馬神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目改變。 4．應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色在電鏡下觀察各亞組大鼠癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作后海馬區(qū)NR2B/PSD-95的動(dòng)態(tài)表達(dá)。 5．應(yīng)用RT-PCR觀察各亞組大鼠癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作后海馬區(qū)NR2B/PSD-95mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)。

12、 6．應(yīng)用Western blot檢測(cè)各亞組大鼠癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作后海馬區(qū)NR2B/PSD-95蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)。 結(jié)果: 1．Morris水迷宮（Morris water maze）、高架十字迷宮（elevated-plus maze）、開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open field）檢測(cè)顯示KA-2w亞組、對(duì)照組及KA+VPA各亞組大鼠的認(rèn)知功能未見明顯區(qū)別，KA各亞組大鼠隨時(shí)間的延長(zhǎng)認(rèn)知功能障礙逐漸加重（P<0．05）。

13、 2．NS-6w、KA+VPA-6w組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回門區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，未見明顯神經(jīng)元丟失。KA-6w亞組大鼠海馬CA1、CA2、CA3、CA4及齒狀回區(qū)未見廣泛神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生，可見局部神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生。 3．NR2B/PSD-95免疫組化研究顯示，對(duì)照組大鼠海馬可見數(shù)目較多、深染的棕褐色NR2B、PSD-95陽性神經(jīng)元。與對(duì)照組比較，KA+VP

14、A各亞組無明顯差別，KA-6w亞組NR2B、PSD-95陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯較少、染色較淺。 4．RT-PCR研究顯示，KA-2w亞組、對(duì)照組及KA+VPA各亞組大鼠NR2B/PSD-95 mRNA的表達(dá)未見明顯區(qū)別，KA各亞組大鼠隨時(shí)間的延長(zhǎng)NR2B/PSD-95 mRNA的表達(dá)逐漸減弱（P<0．05）。 5．Western blot研究顯示，KA-2w亞組、對(duì)照組及KA+VPA各亞組大鼠NR2B/PSD-95蛋白的表達(dá)

15、未見明顯區(qū)別，KA各亞組大鼠隨時(shí)間的延長(zhǎng)NR2B/PSD-95蛋白的表達(dá)逐漸減弱（P<0．05）。 結(jié)論: 1．顳葉癲癇大鼠長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可以導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，且隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重。 2．本實(shí)驗(yàn)中顳葉癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作6w后未見未見廣泛神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生，可見局部性神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生。 3．顳葉癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致NR2B/PSD-95表達(dá)逐漸減弱，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。 4．VPA可以通過保護(hù)

16、NR2B/PSD-95的表達(dá)，減輕顳葉癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙。 研究意義: 本研究應(yīng)用KA制造大鼠顳葉癲癇模型，應(yīng)用行為學(xué)方法檢測(cè)顳葉癲癇導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，首次在成體動(dòng)物水平證實(shí)突觸重塑相關(guān)蛋白如NR2B、PSD-95、synaptophysin、SNAP-25、synaptotagmin1參與顳葉癲癇發(fā)作導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，并同時(shí)證實(shí)了抗癲癇藥物VPA可以通過保護(hù)NR2B/PSD-95的表達(dá)，減輕顳葉癲癇