突觸囊泡蛋白2A在顳葉癲癇海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)及功能研究.pdf

1、顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy,TLE）是目前成人最常見的藥物難治性癲癇，發(fā)病機(jī)制不清。致癇灶內(nèi)反應(yīng)性星型膠質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大可能參與了顳葉癲癇發(fā)生過程，深入研究致癇灶內(nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞功能可能為癲癇治療帶來的策略。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放膠質(zhì)遞質(zhì)可同步調(diào)節(jié)大量神經(jīng)元活動(dòng)，類似于神經(jīng)遞質(zhì)的量子化釋放，囊泡介導(dǎo)的胞吐過程是膠質(zhì)遞質(zhì)釋放的重要途徑，需要一系列分泌相關(guān)蛋白的參與。突觸囊泡蛋白2A(synaptic

2、 vesicle protein2A,SV2A)是腦內(nèi)突觸傳遞的重要正向調(diào)節(jié)蛋白，在囊泡胞吐和維持 Ca2+穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，目前研究發(fā)現(xiàn)新型抗癲癇藥物左乙拉西坦有可能通過SV2A介導(dǎo)抗癲癇作用，提示SV2A在癲癇發(fā)生過程中扮演重要角色，前期我課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)星型膠質(zhì)細(xì)胞在病理狀態(tài)下表達(dá)SV2A,藉此我們提出假設(shè)：反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SV2A促進(jìn)了局部神經(jīng)回路興奮性增高，繼而介導(dǎo)慢性顳葉癲癇的形成。
　　目的:觀察 SV2A

3、在顳葉癲癇病人和動(dòng)物模型海馬中的表達(dá)特征，以及在星型膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)特點(diǎn)和超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在離體水平探討 SV2A參與活化狀態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞的促興奮機(jī)制。
　　方法:免疫組化染色觀察SV2A在顳葉癲癇患者海馬區(qū)和顳葉皮質(zhì)中的表達(dá)變化。建立大鼠鋰-匹羅卡品模型，比較SE后24h、1w、4w、8w SV2A在海馬各區(qū)的分布特點(diǎn)及其 mRNA和蛋白水平的變化。免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)顳葉癲癇患者及動(dòng)物模型 SE后上述時(shí)點(diǎn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上SV2A的

4、表達(dá)特點(diǎn)，并通過免疫電鏡對(duì)SE后4w星形膠質(zhì)細(xì)胞上的 SV2A進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。LPS干預(yù)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞以模擬其在硬化海馬時(shí)的變化，于24h和48h后檢測(cè)SV2A的蛋白表達(dá)及分布；單獨(dú)給予星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員劑ATP或聯(lián)合LPS干預(yù)后12h、24h觀察SV2A蛋白表達(dá)的變化；利用si-RNA干擾技術(shù)降低SV2A的表達(dá)后觀察Ca2+感受器突觸結(jié)合蛋白4（synaptotagmin4,Syt-4）mRNA的變化，以及LPS和

5、LPS+ATP干預(yù)后Syt-4與SV2A mRNA水平的變化趨勢(shì)。
　　結(jié)果:（1）TLE-HS患者海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)中陽性表達(dá)的 SV2A明顯少于對(duì)照組（P<0.05）。動(dòng)物模型急性期（SE后24h）、潛伏期（SE后1w）、慢性期早期（SE后4w）海馬區(qū)SV2A mRNA和蛋白水平均低于對(duì)照組（P<0.05）；免疫組化顯示SE后1w、4w時(shí)SV2A在CA3區(qū)透明層和DG門區(qū)的分布明顯下降（P<0.05）。
　?。?）TLE-

6、HS患者海馬區(qū)AST上SV2A的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。大鼠對(duì)照組及SE后24h海馬AST上均未檢測(cè)出SV2A的表達(dá)，而SE后1w時(shí)部分AST上已出現(xiàn)SV2A的表達(dá)，至SE后4w、8w時(shí)可見增生肥大的AST，硬化海馬各區(qū)AST上均有SV2A的陽性表達(dá)；免疫電鏡示對(duì)照組AST上極少出現(xiàn)SV2A的表達(dá)，但SE后4w硬化海馬AST的胞漿及膠質(zhì)絲上均有SV2A標(biāo)記的銀染顆粒。
　?。?）LPS活化AST24h、48h后S

7、V2A蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.05），免疫熒光顯示AST胞漿及突起上均有SV2A的廣泛分布；單獨(dú)給予ATP干預(yù)不影響SV2A的蛋白表達(dá)，但聯(lián)合LPS刺激24h后SV2A的蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。siRNA干擾AST SV2A的表達(dá)可降低Syt-4 mRNA水平（P＜0.05）；LPS單獨(dú)或聯(lián)合ATP干預(yù)后6h、12h、24h Syt-4與SV2A mRNA水平呈現(xiàn)一致性升高趨勢(shì)。
　　結(jié)論: TLE患者海馬和顳葉皮質(zhì)標(biāo)

8、本中SV2A的表達(dá)降低，動(dòng)物模型SE后各時(shí)點(diǎn)海馬區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了上述變化；SV2A的這種表達(dá)變化可能與SE后神經(jīng)元凋亡和正常突觸聯(lián)系受損有關(guān)。人腦標(biāo)本和動(dòng)物模型慢性期硬化海馬的AST上SV2A的表達(dá)異常增多，提示AST上的SV2A可能參與了癲癇發(fā)生的機(jī)制。ATP可升高活化狀態(tài)下AST上SV2A的表達(dá)；AST中SV2A的變化影響了Ca2+依賴性谷氨酸釋放通路關(guān)鍵分子Syt-4的表達(dá)。提示病理?xiàng)l件下AST中異常升高的SV2A可能通過調(diào)控Syt-