吸附于沙塵暴顆粒物上的微生物對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、沙塵暴(sand dust,SD)是中國(guó)北方較為常見(jiàn)的一種災(zāi)害性天氣現(xiàn)象,近年來(lái)沙塵暴的發(fā)生頻率越來(lái)越高并且波及范圍越來(lái)越廣。常發(fā)生在春季的亞洲沙塵暴(ASD)起源于戈壁沙漠、塔克拉瑪干沙漠等中國(guó)內(nèi)陸黃土地區(qū),顆粒物向下風(fēng)向地區(qū)擴(kuò)散,不僅波及中國(guó)東部、朝鮮半島和同本,更遠(yuǎn)的可以飄過(guò)太平洋最終到達(dá)美國(guó),遍及大半個(gè)北半球。ASD由于吸附性強(qiáng),可攜帶多種化學(xué)物質(zhì),如來(lái)源于大氣污染物(SO2,NO2)的硫酸鹽(SO42-)和硝酸鹽(NO3-),

2、還包括一些微生物,如細(xì)菌、真菌、真菌孢子和病毒。近年來(lái),隨著這種生物氣溶膠(生物顆粒)對(duì)所波及地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康造成嚴(yán)重影響,吸附于ASD上的微生物群落引起了廣泛關(guān)注。
　　 亞洲沙塵暴浮塵顆粒物及這些微生物與呼吸系統(tǒng)的健康狀況及迅速增長(zhǎng)的發(fā)病率、死亡率有關(guān)。大量的流行病學(xué)調(diào)查顯示,在沙塵暴發(fā)生期間,中國(guó)的肺炎入院率和韓國(guó)首爾的每日死亡率都有增加。有報(bào)道稱(chēng),在臺(tái)灣,沙塵暴發(fā)生與死亡率、心血管疾病的急診處理以及肺炎入院率的增

3、多保持一致。類(lèi)似的現(xiàn)象在日本也有報(bào)道,日本雪杉樹(shù)引起的花粉病、季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎的惡化以及成人和兒童哮喘的加劇都在沙塵暴發(fā)生期間出現(xiàn)。因此,流行病調(diào)查結(jié)果表明在沙塵暴發(fā)生期間,由微生物和ASD聯(lián)合作用可引起肺炎或過(guò)敏性疾病的惡化,需要實(shí)驗(yàn)性的研究來(lái)證實(shí)流行病調(diào)查的結(jié)果。
　　 我們以前的研究顯示,在OVA刺激的小鼠氣道上皮組織中發(fā)現(xiàn),通過(guò)觀察支氣管肺泡灌沈液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)和組織

4、學(xué)檢查細(xì)胞圖像,野生型ASD可增強(qiáng)過(guò)敏性氣道炎癥及杯狀細(xì)胞的增殖,同時(shí)發(fā)現(xiàn)伴有嗜酸性粒細(xì)胞的抗原相關(guān)氣道炎癥加劇了,BALF中促炎癥細(xì)胞因子如IL-5、MCP-3、IL-13、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子和抗原特異抗體的產(chǎn)物(IgE,IgG1)的表達(dá)增強(qiáng)。然而,經(jīng)過(guò)360℃加熱除去毒性物質(zhì)(如微生物、SO42-、NO3-等)的ASD(heated AsD,H-ASD)卻只造成了輕微的影響,因此沙塵暴顆粒物表面附著物對(duì)炎癥加劇起到了重要作用。

5、r>　　 本研究中使用電子加熱器將采集于日本福岡縣北九州市的沙塵暴顆粒的樣本進(jìn)行加熱處理,以除去吸附于其表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。本實(shí)驗(yàn)采用的微生物來(lái)自于石川縣珠洲市上空的顆粒表面,共7種微生物,有:Nocardiopsis sp.(No.1-4),Bacillus sP.,Streptmyces sp.和Bjerkandera sp-。本研究應(yīng)用OVA致敏小鼠,采用氣管灌注的方法,分別將加熱處理的ASD(H-ASD)

6、、和加入各種微生物的H-ASD懸浮液注入小鼠氣管內(nèi),觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化,支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞的分布變化,BALF中細(xì)胞因子和趨化性細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)改變。從中篩選出一種惡化作用最為強(qiáng)烈的微生物,進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。本研究是關(guān)于沙塵暴顆粒物附著的微生物對(duì)OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道炎癥作用的研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、樣本的采集
　　 本研究使用的黃沙在2011年5月1日至3日在日本福

7、岡北九州市折尾地區(qū)的產(chǎn)業(yè)醫(yī)科大學(xué)上空采集,由LIDAR(Light Detection And Ranging)檢測(cè)這批顆粒物的密度變化為350μg～550μg/m3(結(jié)果來(lái)自于日本長(zhǎng)崎縣公共健康與環(huán)境科學(xué)省)。應(yīng)用圖像分析軟件(OLS3500/SFT-3500,Olympus and Shimadzu)分析顯微圖像得到顆粒的粒徑大小,該方法最低檢出限為1μm,粒徑分布主要在2.8～5.9μm。
　　 2、樣本的處理
　　

8、 分別將采集到的ASD樣本在電子加熱器中經(jīng)過(guò)360℃加熱處理30min,以除去吸附于顆粒物表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。
　　 3、微生物的分離及獲取
　　 本研究使用的7種微生物是在2008年5月7日日本石川縣珠洲市采集的黃沙顆粒上分離培養(yǎng)的。將采集到的黃沙分別用營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂以及沙保羅培養(yǎng)基培養(yǎng),得到7種微生物。經(jīng)過(guò)DNA分析,確定它們分別是Nocardiopsis sp.(No.1

9、-4),Bacillus sp.,Streptomyces sp.和Bjercandera SP.。這些微生物用1%福爾馬林1小時(shí)失活,而后以1500rpm離心10min,去掉上清液,余下減壓干燥備用。
　　 4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及染毒
　　 從Charles River公司(神奈川,日本)購(gòu)入5周齡雄性ICR小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,篩選出體重異常和/或病態(tài)的小鼠,開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。根據(jù)微生物種類(lèi)的不同將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成9個(gè)組,每組1-5只

10、不等,各實(shí)驗(yàn)組分別為:卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)組,OVA+H-ASD組,OVA+H-ASD+Nocardiopsis sp.(No.1-4),OVA+H-ASD+Bacillus sp.,OVA+H-ASD+Streptomyces sp.和OVA+H-ASD+Biercandera sp.,共29只。每周將小鼠在4%三氟溴氯乙烷作用下麻醉,經(jīng)氣管注入H-ASD(0.1ml/mouse)和OVA(0.1ml/mouse)以

11、及7種失活微生物3.5μg,共投與四次。
　　 在取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果之后,選出作用最強(qiáng)的一種微生物,繼續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。每間隔一周,將小鼠4%三氟溴氯乙烷作用下麻醉,經(jīng)氣管注入顆粒物(0.1ml/mouse)和/或OVA(0.1ml/mouse)和/或微生物(2μg/mouse或8μg/mouse)。最后一次染毒的第二天,經(jīng)小鼠腹腔注射20%/戊戈巴比妥,將其深度麻醉,用放血法處死。
　　 5、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理檢測(cè)
　　 取小

12、鼠肺部固定于10%中性福爾馬林緩沖液中,肺葉分離后,將其切割成2mm厚的碎塊,用石蠟包埋,制成3μm厚的切片。HE染色后觀察呼吸道由近端向遠(yuǎn)端嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。PAS染色后觀察支氣管上皮杯狀細(xì)胞的增殖情況。應(yīng)用顯微鏡對(duì)每個(gè)切片的呼吸道中炎癥細(xì)胞和上皮細(xì)胞進(jìn)行觀察。
　　 6、采集支氣管肺泡灌洗液和血液
　　 小鼠深度麻醉后心臟采血,1500rpm離心10min,取上清液,-80℃的深度冰箱中保存用于檢測(cè)血清

13、OVA特異性抗體IgGl和IgE的表達(dá)。取小鼠心臟血后,氣管固定,用無(wú)菌生理鹽水灌洗小鼠肺部?jī)纱?收集灌洗液后離心。取上清液,-80℃的深度冰箱中保存,用于檢測(cè)肺泡灌洗液中細(xì)胞因子和趨化因子的蛋白表達(dá)。
　　 7、支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　 將肺泡灌洗液離心后得到的沉淀懸浮于生理鹽水中,制成細(xì)胞懸液,顯微鏡下應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞懸液應(yīng)用細(xì)胞離心涂片機(jī),離心后制成細(xì)胞涂片。應(yīng)用Diff-Quik染

14、色后,顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
　　 8、支氣管肺泡灌沈液中的細(xì)胞因子和趨化因子的檢測(cè)
　　 應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子和趨化因子的蛋白表達(dá)。其中細(xì)胞因子包括:白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、干擾素(interferon,INF)-γ和腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-

15、α)、趨化因子包括:嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)、調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子(regulated on activation normal T cell expressed and presumably secreted,RANTES)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein,MIP)-1α、角化細(xì)胞趨化因(Keratinocyte chemoattractant,KC)、單

16、核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotacticprotein,MCP)-1和MCP-3。
　　 9、OVA特異性IgE和IgG1抗體的檢測(cè)
　　 用鼠OVA-IgEELISA試劑盒和鼠OVA-IgG1ELISA試劑盒檢測(cè)血清中的OVA特異性IgE和IgG1抗體。
　　 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 本研究應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表述為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,采用單因素方差分析比較不同染

17、毒組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);當(dāng)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),采用SNK法進(jìn)行組間比較,p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、ASD表面成分的檢測(cè)結(jié)果
　　 ASD顆粒物的大小主要分布為2.8～5.9μm。ASD顆粒物的各種元素分布為28%Si、7%Al、3.8%Fe、3.2%Ca、1.8%Mg、0.36%Ti、0.10%P、0.091%Mn、0.051%Ba和0.025%Sr。
　　 2、7種微生物對(duì)

18、小鼠肺部病理學(xué)改變的影響
　　 OVA+H-ASD+Streptmyces sp.與OVA+H-ASD+Bjerkanderasp.組發(fā)現(xiàn),與OVA+H-ASD組相比,小鼠肺呼吸道上皮中的杯狀細(xì)胞顯著增殖,特別是Bjerkandera sp.組增生最顯著,小鼠氣管粘膜下嗜酸性粒細(xì)胞顯著增多。
　　 3、7種微生物對(duì)小鼠支氣管肺泡灌沈液中炎癥細(xì)胞分布的影響
　　 OVA+H-ASD+Bierkandera sp.組

19、小鼠BALF中巨噬細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞與OVA組比較顯著增多。
　　 4、7種微生物對(duì)小鼠支氣管肺泡灌沈液中細(xì)胞因子和趨化性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 Bjerkandera聯(lián)合作用組的KC、MCP-1、RANTES、MCP-3、IL-12水平升高。
　　 5、Bjerkandera sp.對(duì)小鼠肺部病理學(xué)改變的影響
　　 OVA+H-ASD+B.Sp聯(lián)合作用能引起小鼠肺呼吸道上皮的杯

20、狀細(xì)胞重度增殖,且氣管粘膜下嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞顯著增多,基底膜增厚,呈現(xiàn)玻璃樣變。
　　 6、Bjerkandera sp.對(duì)小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞分布的影響
　　 與OVA+H-ASD相比,OVA+H-ASD+B.sp組小鼠BALF中巨噬細(xì)胞的含量增多。與H-ASD+B.sp2和H-ASD+B.sp8組分別比較,OVA+H-ASD+B.sp2/B.sp8聯(lián)合處理進(jìn)一步導(dǎo)致小鼠BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)增多。

21、
　　 7、Bjerkandera sp.對(duì)小鼠支氣管肺泡灌沈液中細(xì)胞因子和趨化性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 OVA+H-ASD+B.sp8聯(lián)合作用組中BALF的IL-1β、IL-6、IL-13和TGF-β1明顯高于對(duì)照組和OVA單獨(dú)作用組,另外,IL-1β、IL-5、IL-13和TGF-β1表達(dá)也強(qiáng)于H-ASD單獨(dú)作用組。H-ASD+B.sps組的小鼠BALF中Eotaxin、RANTES、KC和MCP-1的水平與對(duì)照組

22、及B.sp8單獨(dú)處理組相比顯著升高。
　　 8、Bjerkandera sp.對(duì)小鼠血清中OVA特異性IgE和IgG1表達(dá)的影響
　　 OVA+H-ASD+B.sp8組小鼠血清中OVA特異性IgG1表達(dá)比B.sps和H-ASD+B.sp8組的表達(dá)增強(qiáng)。在所有組別中未見(jiàn)OVA特異性IgE的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、7種微生物,特別是Bjerkandera sp.,能加劇OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠的氣道炎癥反