治療更年期綜合征常用中藥雌激素樣作用的實驗研究.pdf

1、更年期綜合征是婦女由于卵巢功能衰退，體內(nèi)分泌的雌激素水平明顯下降，引起的心血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂，導致功能性子宮出血、陣發(fā)性潮熱和出汗、外陰及陰道萎縮、骨質(zhì)疏松等癥狀及出現(xiàn)精神和植物神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀。隨著我國人口結(jié)構(gòu)不斷的老齡化，該病有發(fā)病年齡提早、發(fā)病率上升的趨勢，嚴重的影響了占婦女一生中1/3時間的圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期的健康問題和生活質(zhì)量。 更年期綜合征發(fā)病率較高，直接影響到更年期婦女的正常工作和生活，目前主要的治療方法

2、為激素替代療法。雌激素是一種作用廣泛的類固醇類激素，不僅對于女性生殖器官的發(fā)育及第二性征的保持具有不可替代的作用，而且對眾多靶組織如生殖道、乳腺、骨骼及心血管系統(tǒng)生長發(fā)育功能有調(diào)節(jié)作用。雌激素替代療法對減輕更年期婦女絕經(jīng)期癥狀、防治骨質(zhì)疏松有很好的效果。然而，長期激素替代療法應用使子宮內(nèi)膜癌的患病風險增加。與孕激素聯(lián)合應用的激素替代療法，雖然能減少這種風險，但乳腺癌及心腦血管病的發(fā)病風險增加，雌激素在臨床長期應用所帶來的不良反應一直困擾

3、著人們。 植物雌激素是一類存在于植物中、與雌激素結(jié)構(gòu)相類似的生物活性物質(zhì)，它能與雌激素受體結(jié)合，并且具有雙向調(diào)節(jié)作用。它能抑制雌激素依賴性腫瘤的生長，減輕更年期綜合征。近來植物雌激素作為雌激素的替代品，以其安全性及顯著的療效，受到越來越多的關(guān)注。中草藥在我國資源豐富，但相關(guān)的植物雌激素的系統(tǒng)研究很少，所以在其中篩選具雌激素作用的藥物，并進一步篩選有效成分意義重大，不僅在理論上，而且在臨床上也是實際可行的。 由于每種中藥的

4、成分比較復雜，并且每種中藥植物雌激素活性不同，我們根據(jù)中醫(yī)對更年期綜合征的辨證論治的原則，結(jié)合文獻中對某些含有植物雌激素中藥的論述，選出治療更年期綜合征的常用中藥，在此基礎上做進一步精簡，篩選出雌激素活性比較強的中藥，減少藥物服用量。同時可以根據(jù)中醫(yī)的組方原則，使中藥組合變成最佳藥物組合，發(fā)揮中藥的最大作用。本課題還可以了解植物雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑的作用路徑及其組織特異性的發(fā)生機制，最終為提高雌激素類藥物的選擇性、優(yōu)化以臨床為

5、基礎的藥物設計提供一條較為系統(tǒng)的思路。 本課題選取了十種治療更年期綜合征的常用中藥(淫羊藿、菟絲子、女貞子、補骨脂、枸杞子、肉蓯蓉、甘草、川牛膝、丹參、紅花)，這些中藥主要分為補腎陰藥、補腎陽藥、活血化瘀藥三大類。在課題中主要從四個方面來研究中藥中的植物雌激素。 第一部分：利用小鼠子宮增重法，觀察十種中藥的雌激素和拮抗雌激素的作用。 植物雌激素在體內(nèi)雌激素水平低的時候發(fā)揮雌激素樣作用，在體內(nèi)雌激素水平高時具有拮抗

6、雌激素的作用。觀察中藥的雌激素作用時，選用剛斷乳的昆明種小鼠120只，分為12組，每組10只，每天給予受試藥物灌胃一次，連續(xù)4天后處死后取子宮稱重。以雌激素為陽性對照藥物，以蒸餾水為正常對照組，根據(jù)藥物對性未成熟小鼠子宮生長的促進作用，采用子宮系數(shù)(子宮濕重/體重×100％)為指標評價其是否具有雌激素作用。從實驗結(jié)果看，在十種中藥中，淫羊藿、菟絲子可使動物子宮系數(shù)明顯升高，與正常對照組相比有極顯著的差異。所有藥物誘導子宮系數(shù)變化后的數(shù)值

7、明顯低于陽性對照組(P＜0.01)。在雌激素拮抗實驗中選用剛斷乳的昆明種小鼠120只，分為12組，每組10只，每天灌胃兩次，一次中藥，一次己烯雌酚。未見某中藥有明顯的拮抗作用。其中，女貞子、補骨脂不但無拮抗作用，還有增強己烯雌酚的作用。 第二部分：觀察十種中藥的血清對MCF-7細胞增殖的影響。采用剛斷乳的昆明種小鼠72只分成12組，分籠喂養(yǎng)3天后，分組、灌胃方法同實驗一。第5天將小鼠摘眼球取血，在4℃條件下2500rpm離心10

8、min，抽取血清。MCF-7細胞是雌激素受體陽性的人乳腺癌細胞，雌激素類物質(zhì)可以明顯促進細胞的增殖。將MCF-7細胞用無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)四天。按組分別加入不同組的含藥血清，共分12組，每組重復6孔。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入MTT，然后每孔再加入200μl二甲基亞砜。在酶標儀上波長為570nm條件下，檢測還原的MTT結(jié)晶的光密度值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①女貞子血清組、淫羊藿血清組、甘草血清組無明顯促進MCF-7增殖

9、的作用。不同的中藥血清在不同時段對細胞的作用也不同。②川牛膝血清組、枸杞子血清組、紅花血清組、補骨脂血清組、菟絲子血清組在三個時段均有顯著的促進MCF-7增殖作用。 拮抗組采用剛斷乳的昆明種小鼠72只，按同樣的方法制備血清，并按上述實驗步驟測出光密度值。有以下結(jié)論：①與陽性組比，丹參、紅花、淫羊藿、補骨脂、菟絲子、甘草的拮抗雌激素引起的細胞增殖作用比較緩，但作用比較強。川牛膝拮抗作用比較弱。②女貞子、枸杞子、肉蓯蓉無明顯拮抗雌激

10、素引起的細胞增殖作用。其中肉蓯蓉在72h時還有增強己烯雌酚的作用。 第三部分：通過HE染色和免疫組化觀察中藥對子宮的影響。從HE結(jié)果來看，陽性組子宮形態(tài)大小明顯大于正常組，補骨脂子宮小于正常組，淫羊藿、紅花、菟絲子等中藥組在一定的程度上大于正常組子宮。正常組鏡下可見子宮內(nèi)膜、肌層、漿膜層基本結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜層腺體豐富，呈簇狀分布。陽性組和淫羊藿、紅花、菟絲子等中藥組鏡下可見子宮內(nèi)膜、肌層、漿膜層基本結(jié)構(gòu)較清晰，內(nèi)膜層腺體較多，子宮

11、內(nèi)膜上皮細胞呈典型的增生分泌狀態(tài)，即胞漿豐富，胞體延長擴大，胞核彌散，基底層變厚。 ERα免疫組化實驗結(jié)果表明，在未發(fā)育成熟的小鼠子宮中，ERα主要表達在子宮內(nèi)膜腔上皮和子宮內(nèi)膜腺上皮細胞上。細胞核和胞漿呈棕黃色，胞核顏色深于胞漿，說明ERα在細胞核表達要強于細胞質(zhì)。部分表達在內(nèi)膜間質(zhì)細胞和平滑肌細胞。與正常組比，紅花、川牛膝、女貞子、枸杞子、肉蓯蓉、淫羊藿、補骨脂、菟絲子組與正常組相比均有顯著差異(P＜0.01)。與陽性組比，

12、只有紅花差異不顯著，說明紅花能明顯促進雌激素受體的表達。 第四部分：通過血清中FSH、LH、E2等測定，確定中藥對小鼠的影響。實驗動物灌胃方法和分組同前。本實驗應用ELISA競爭法觀測中藥對小鼠血清內(nèi)三種激素的影響。實驗結(jié)論如下：①補骨脂組與淫羊藿組能降低小鼠血清中FSH水平。②紅花能升高小鼠血清LH值。③菟絲子和紅花能升高小鼠血清E2水平。陽性組血清的E2低于正常組，可能是因為己烯雌酚的反饋性的抑制了小鼠體內(nèi)E2的生成。