小鼠活體內(nèi)泡狀棘球蚴熒光成像模型建立方法的探討.pdf

1、背景:
　　肝泡狀球蚴病作為一種重要的人畜共患寄生蟲病威脅著北半球廣大牧區(qū)居民的生命安生。現(xiàn)有的治療肝泡球蚴病的藥物如阿苯達唑等往往對泡球蚴只能起到抑制作用，而對其的殺滅作用有限，對于少數(shù)病例甚至無效，且停藥后復發(fā)率較高，因此有必要進一步尋找更佳的抗肝泡球蚴病的藥物。以往的肝泡球蚴藥敏實驗模型主要依靠計算囊濕重、免疫組織化學染色等病理解剖學手段觀察病灶對藥物的反應情況，不僅操作繁瑣、費時費力且無法對同一實驗動物進行縱向監(jiān)測。近十年

2、來，活體內(nèi)熒光成像技術的不斷發(fā)展使活體內(nèi)動態(tài)觀察腫瘤、感染等病灶成為了可能。
　　目的:
　　建立一種活體小鼠體內(nèi)泡狀棘球蚴原頭節(jié)熒光成像模型，為今后的泡狀棘球蚴病體內(nèi)實驗提供可動態(tài)觀察的動物模型。
　　方法:
　　從感染泡狀棘球蚴的實驗室長爪沙鼠體內(nèi)獲得泡球蚴囊泡，分離、研磨并過濾得到泡狀棘球蚴原頭節(jié)，體外培養(yǎng)。分別使用不同濃度的二甲雙胍、阿苯達唑及二者聯(lián)合處理原頭蚴，使用臺盼藍外排實驗測定頭節(jié)活性。使用JC-

3、1線粒體膜電位指示劑對三組原頭節(jié)進行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并測定原頭節(jié)所發(fā)射出的紅/綠熒光比值以及紅、綠熒光各自隨時間的變化情況。隨后將三組原頭節(jié)分別種入三組BALB/c小鼠的肝被膜下，使用IVISLumina活體小動物成像儀對小鼠進行成像，測定紅/綠熒光比值并與體外測定結果進行對比。最后觀察自然條件下（不使用抗包蟲藥物）觀測JC-1熒光的衰減情況，繪制曲線。
　　結果:亞甲藍外排實驗測得10 mM二甲雙胍處理組原頭節(jié)活性

4、為27.43％（51/186），低于對照組（96.27%,136/141）、1mM二甲雙胍處理組（90.01%,158/175）以及5mM二甲雙胍處理組（73.48%,113/153）（P＜0.05）。15μM阿苯達唑與10 mM二甲雙胍與聯(lián)合使用處理組的原頭節(jié)活性為4.63%（5/107），低于其與5mM二甲雙胍聯(lián)合處理組（46.30%,82/177）、與1mM二甲雙胍聯(lián)合處理組（69.73%,103/147）及15μM阿苯達唑單獨處

5、理組（82.35%,198/240）（P＜0.05）。
　　激光共聚焦顯微鏡下可觀察到阿苯達唑聯(lián)合二甲雙胍處理組的原頭節(jié)體內(nèi) JC-1紅綠熒光比值為0.29，低于二甲雙胍單獨處理組（1.06）及對照組（4.53）（P＜0.05）。說明聯(lián)合處理組原頭節(jié)的線粒體功能較二甲雙胍單獨處理組和對照組明顯減退，與之前的亞甲藍外排實驗結果相一致，提示二甲雙胍是通過抑制原頭節(jié)的線粒體功能進而導致能量代謝障礙起到抗泡球蚴作用的。在體外分別對上述三組

6、原頭節(jié)的紅、綠熒光作動態(tài)觀察記錄，結果顯示聯(lián)合治療組的紅色熒光的衰減速度明顯快于二甲雙胍單獨治療組及對照組。到48小時后，三組紅色熒光之間無明顯差異，提示此時紅色熒光的衰減已經(jīng)影響到原頭節(jié)活性監(jiān)測的準確性。綠色熒光方面，二甲雙胍處理組的綠色熒光在24h、36h和48h均明顯強于未處理組（P＜0.01），聯(lián)合處理組的綠色熒光24h和36h明顯強于二甲雙胍處理組。
　　將三組原頭節(jié)分別注射入小鼠的肝被膜下，進行活體內(nèi)熒光成像。測得二甲

7、雙胍處理組原頭節(jié)的紅綠熒光比值明顯低于未處理組原頭節(jié)（P＜0.01），而聯(lián)合處理組原頭節(jié)的紅綠熒光比值又明顯低于二甲雙胍處理組（P＜0.01）。這與之前體外激光共聚焦測得的結果相吻合，說明使用JC-1作為標記物可以較好地進行泡球蚴活體內(nèi)熒光成像，且病灶部位紅綠熒光比值可以較為準確地反映此處泡球蚴原頭節(jié)的活性。對注射了未處理組原頭節(jié)的小鼠進行動態(tài)熒光成像監(jiān)測，結果示紅色熒光的衰減略快于綠色熒光，可能與非結合態(tài)的JC-1的抗熒光漂白能力強于