核磁共振對(duì)吐溫80與中藥化學(xué)成分相互作用的研究.pdf

1、目的：
　　中藥注射劑的不良反應(yīng)已受到人們的高度重視，過多地把“責(zé)任”推給吐溫80的說法不能自圓其說。我們對(duì)吐溫80在化學(xué)不穩(wěn)定性方面的研究進(jìn)行了文獻(xiàn)整理和分析，認(rèn)為，在進(jìn)行中藥注射劑不良反應(yīng)的研究過程中，除了把作為溶質(zhì)的中藥化學(xué)成分和作為溶劑的吐溫80納入考慮的范疇外，還應(yīng)該充分地考慮到中藥化學(xué)成分和吐溫80的相互作用的問題。由此，我們從含有吐溫80的中藥注射劑--魚腥草注射液出發(fā)，對(duì)吐溫80與中藥化學(xué)成分之間是否會(huì)相互反應(yīng)產(chǎn)生

2、新物質(zhì)進(jìn)行了探索性研究。根據(jù)核磁共振氫譜(1H NMR)可以在溶液狀態(tài)中比較全面地反映物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的性質(zhì)，我們?cè)谕聹?0與魚腥草揮發(fā)油的混合溶液的1H NMR譜中發(fā)現(xiàn)了有新物質(zhì)峰(δ8.30ppm峰)出現(xiàn)，而魚腥草揮發(fā)油中的醛類化合物的醛基質(zhì)子峰顯著下降甚至消失。另外，我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，魚腥草注射液的1H NMR中也出現(xiàn)了δ8.30ppm的物質(zhì)峰，而醛基質(zhì)子峰峰度極低。
　　圍繞魚腥草注射液的1HNMR譜δ8.30ppm新物質(zhì)峰的出現(xiàn)

3、和醛基質(zhì)子峰峰度降低的這個(gè)現(xiàn)象，我們考察了魚腥草注射液中、吐溫80與魚腥草揮發(fā)油混合物中δ8.30ppm峰隨時(shí)間、溫度不同的變化情況，研究了δ8.30ppm峰新物質(zhì)的溶解性質(zhì)，考察了不同產(chǎn)家的吐溫80對(duì)魚腥草揮發(fā)油的影響，考察了多個(gè)化合物分別與吐溫80混合后的1HNMR譜δ8.30ppm峰出現(xiàn)情況并進(jìn)一步測(cè)定了月桂醛與吐溫80的混合溶液的核磁共振二維譜，探索月桂醛與吐溫80相互反應(yīng)的最佳物質(zhì)量比和最佳反應(yīng)時(shí)間，考察了多個(gè)中藥注射液的1H

4、NMR譜δ8.30ppm峰出現(xiàn)情況并進(jìn)一步進(jìn)行了核磁共振二維譜的測(cè)定，考察吐溫80中所含雜質(zhì)對(duì)δ8.30ppm峰新物質(zhì)生成的影響。希望通過我們的研究，對(duì)吐溫80與中藥化學(xué)成分的相互作用的規(guī)律有一個(gè)初步的認(rèn)識(shí)。
　　方法：
　　(1)文獻(xiàn)：以吐溫80為關(guān)鍵詞，系統(tǒng)檢索到目前為止的PubMed、Wiley OnlineLibrary、Sciellce、ScienceDirect、Highwire、Biomed Central、C

5、NKI等國內(nèi)外多個(gè)數(shù)據(jù)庫，引用42篇相關(guān)的參考文獻(xiàn)，按有機(jī)化學(xué)反應(yīng)的分類，對(duì)吐溫80的不穩(wěn)定性進(jìn)行了文獻(xiàn)的整理和綜述。
　　(2)核磁共振技術(shù)：采用400.17MHz頻率的核磁共振儀，對(duì)化合物與吐溫80的混合液進(jìn)行檢測(cè)，掃描16次，測(cè)定溫度295K，溶劑D2O的化學(xué)位移為δ4.70ppm、CDCl2的化學(xué)位移為δ7.26ppm，以信噪比來衡量質(zhì)子峰的大小和反映被測(cè)物質(zhì)的含量，對(duì)化合物與吐溫80混合后的1H NMR譜與化合物本身、吐

6、溫80本身的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)新產(chǎn)生的物質(zhì)峰以及考察新物質(zhì)峰的變化情況。
　　(3)新物質(zhì)穩(wěn)定性考察：魚腥草注射液一經(jīng)生產(chǎn)出來就置于陰涼避光的室溫(20℃)中放置，作為0月加速試驗(yàn)的樣品。進(jìn)行高溫加速試驗(yàn)的注射液樣品置于人工氣候箱中，設(shè)定40℃恒溫、75％RH恒濕條件下。在放置1月、2月、3月后，分別作為1、2、3月加速試驗(yàn)的樣品。各樣品在加速試驗(yàn)期滿后，取出安瓿瓶，打開，直接冷凍干燥至干，粉末以0.5mL D2O

7、溶解，測(cè)定1H NMR。
　　對(duì)出廠生產(chǎn)的魚腥草注射液置于陰涼避光的室溫(20℃)中放置3個(gè)月，作為室溫貯存的樣品。另外，部分樣品放置于冰箱的冷藏箱中，設(shè)定溫度為4℃，也放置3個(gè)月，作為低溫貯存的樣品。這2個(gè)樣品在貯存期滿后，打開安瓿瓶，冷凍干燥至干，粉末以0.5mL D2O溶解，測(cè)定1H NMR。
　　(4)化合物研究：將購買的各個(gè)化合物和實(shí)驗(yàn)室自制的魚腥草揮發(fā)油分別與吐溫80混合，攪勻，逐滴加入0.5～0.6mL重水，邊

8、加邊搖勻，室溫放置48h，測(cè)定1H NMR。
　　(5)中藥注射液的研究：將買來的中藥注射液進(jìn)行冷凍干燥，取凍干粉約20mg用重水溶解，測(cè)定1H NMR。
　　(6)吐溫80中雜質(zhì)的研究：分析吐溫80中可能存在的雜質(zhì)，選取對(duì)δ8.30ppm峰新物質(zhì)形成影響比較大的雜質(zhì)(月桂酸或油酸)，與吐溫80、月桂醛進(jìn)行混合后，加入0.5mL重水，混勻后檢測(cè)1H NMR。
　　結(jié)果：
　　(1)文獻(xiàn)中關(guān)于吐溫80化學(xué)不穩(wěn)定方面

9、包括：水解反應(yīng)、絡(luò)合反應(yīng)、自氧化反應(yīng)、聚合反應(yīng)、光降解反應(yīng)和其它尚不明確的化學(xué)反應(yīng)。
　　(2)剛出廠合格的魚腥草注射液的的1H NMR譜中的醛基峰幾乎消失，出現(xiàn)了δ8.30ppm新物質(zhì)峰，并且該新物質(zhì)峰在魚腥草注射液加速1個(gè)月明顯升高，再加速2個(gè)月、3個(gè)月不再明顯變化。在低溫和室溫放置3個(gè)月，兩種情況下的新物質(zhì)峰高度相當(dāng)且都較低，但是高溫放置3個(gè)月，新物質(zhì)峰則出現(xiàn)明顯升高。魚腥草揮發(fā)油的1H NMR譜有明顯的δ9.60ppm的醛

10、基峰，沒有δ8.30ppm物質(zhì)峰，吐溫80的1H NMR譜在6～10ppm范圍都不出現(xiàn)物質(zhì)峰，而魚腥草揮發(fā)油與吐溫80混合后的1H NMR譜中出現(xiàn)了δ8.30ppm物質(zhì)峰，位于δ9.60ppm位移的醛基峰的降低或消失。將魚腥草揮發(fā)油與吐溫80的混合液室溫放置5個(gè)月后檢測(cè)1H NMR譜，新物質(zhì)峰出現(xiàn)明顯升高。
　　(3)用乙醚萃取分離魚腥草注射液，檢測(cè)乙醚層和水層的1H NMR譜。δ8.30ppm峰新物質(zhì)出現(xiàn)在水層，同時(shí)在該峰附近δ

11、8.50ppm處又出現(xiàn)了一個(gè)新峰；乙醚層的譜圖中有δ9.60ppm醛基峰，在δ8.30ppm及其附近沒有出現(xiàn)任何物質(zhì)峰。
　　(4)選取來自國內(nèi)外4個(gè)不同產(chǎn)家的吐溫80分別與魚腥草揮發(fā)油、不同的醛類化合物混合后檢測(cè)1H NMR譜。4個(gè)產(chǎn)家有3家的吐溫80與魚腥草揮發(fā)油混合后產(chǎn)生了δ8.30ppm新峰，而沒有產(chǎn)生δ8.30ppm峰的國藥集團(tuán)產(chǎn)的吐溫80與醛類化合物混合后又產(chǎn)生了δ8.30ppm物質(zhì)峰。
　　(5)選取不同類型的

12、40個(gè)化合物分別與吐溫80混合后檢測(cè)1H NMR譜。有34個(gè)化合物與吐溫80混合后的1H NMR譜有異常峰出現(xiàn)，其中29個(gè)產(chǎn)生了明顯的δ8.30ppm新物質(zhì)峰，其它5個(gè)則產(chǎn)生了別的異常物質(zhì)峰。薯蕷皂苷等6個(gè)化合物與吐溫80混合后沒有發(fā)生變化。月桂醛與吐溫80的混合液的H-H COSY沒有出現(xiàn)與δ8.30ppm峰相關(guān)的物質(zhì)峰，其放置一個(gè)月后的的HMQC譜顯示δ8.30ppm物質(zhì)峰與166.3ppm的碳相關(guān)聯(lián)。月桂醛與吐溫80不同摩爾比混合

13、(分別為0.1:1、0.33:1、1:1、3.3:1、10:1)，室溫放置0月、1月、2月，測(cè)定1H NMR譜；0月時(shí)，5個(gè)樣品的醛基峰隨月桂醛的濃度增大而升高，而產(chǎn)生的δ8.30ppm新物質(zhì)峰高度相當(dāng)；放置1個(gè)月后，醛基峰均明顯降低，而δ8.30ppm峰明顯升高，且信噪比都在8左右，并在δ8.10ppm處出現(xiàn)了異常峰；放置2個(gè)月后，醛基峰不再下降，δ8.30ppm新物質(zhì)峰也不再升高，δ8.10ppm異常峰稍有升高。
　　(6)對(duì)

14、16個(gè)中藥注射液(含有吐溫80的注射液11個(gè)、不含吐溫80的注射液5個(gè))的1H NMR譜進(jìn)行測(cè)定。復(fù)方當(dāng)歸注射液等11個(gè)含有吐溫80的中藥注射液，除莪術(shù)油注射液外，1H NMR譜圖都產(chǎn)生了δ8.30ppm物質(zhì)峰。紅花注射液等5個(gè)不含吐溫80的注射液也都產(chǎn)生了δ8.30ppm物質(zhì)峰。對(duì)紅花、野木瓜等6個(gè)中藥注射液，測(cè)定了核磁共振二維譜，只有不含吐溫80的丹參注射液和紅花注射液產(chǎn)生了與δ8.30ppm峰相關(guān)的13C峰，其余4個(gè)注射液未見與δ

15、8.30ppm峰相關(guān)的13C峰。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，產(chǎn)生δ8.30ppm峰的物質(zhì)可能是丹參注射液中的丹參酮Ⅰ和紅花注射液中的腺苷。但是，板藍(lán)根注射液也可能含有腺苷，但沒有見到與δ8.30ppm峰相關(guān)的13C峰。
　　(7)吐溫80中的雜質(zhì)可能有環(huán)氧乙烷、過氧化物等副反應(yīng)產(chǎn)物，這些成分大多不穩(wěn)定且有毒，在國家藥典中是有明確含量限制的。吐溫80中可能含有來自合成原料油酸、月桂酸等雜質(zhì)，為此將月桂酸+吐溫80+月桂醛、油酸+吐溫80+月

16、桂醛的兩種混合物測(cè)定了1H NMR譜，可見δ8.30ppm峰并沒有升高，放置一個(gè)月后再檢測(cè)，δ8.30ppm峰也沒有明顯變化。
　　結(jié)論：
　　(1)吐溫80的穩(wěn)定性和安全性是相對(duì)的。
　　(2)吐溫80會(huì)使魚腥草揮發(fā)油中的醛類成分發(fā)生變化形成δ8.30ppm峰新物質(zhì)，魚腥草注射液也含有該新物質(zhì)。該新物質(zhì)的形成受溫度的影響較大。
　　(3)δ8.30ppm峰新物質(zhì)為水溶性且具有對(duì)熱不穩(wěn)定的性質(zhì)，用乙醚萃取后魚腥草

17、注射液的水層的氫譜圖δ8.50ppm位移處出現(xiàn)一個(gè)新峰，很可能是δ8.30ppm峰物質(zhì)在萃取揮干過程中發(fā)生了分解或異構(gòu)的緣故。
　　(4)δ8.30ppm峰新物質(zhì)的產(chǎn)生與吐溫80的產(chǎn)家或來源無關(guān)。
　　(5)吐溫80能使多數(shù)中藥化合物形成δ8.30ppm峰新物質(zhì)，也可能形成其他新物質(zhì)物質(zhì)峰；形成的δ8.30ppm峰很可能是一個(gè)孤立醛基質(zhì)子峰；形成δ8.30ppm峰新物質(zhì)的最佳反應(yīng)物質(zhì)量比為3.3:1，反應(yīng)時(shí)間為三個(gè)月或以上。