腸桿菌enterobacter.spcn1產(chǎn)氫代謝調(diào)控及其產(chǎn)氫相關(guān)基因的研究

1、IIII摘要隨著化石能源的日益短缺和環(huán)境保護(hù)要求的逐漸提高，氫能源作為清潔、高效的可再生能源越來(lái)越受到人們的重視。制取氫氣的方法多種多樣，例如物理制氫、化學(xué)制氫和生物制氫。發(fā)酵生物制氫成為生物制氫技術(shù)的最佳選擇是因?yàn)樗哂挟a(chǎn)氫能力高、穩(wěn)定性好、可實(shí)現(xiàn)廢物處理資源化等優(yōu)點(diǎn)。然而，自然界中野生菌株產(chǎn)氫效率低一直是厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫工業(yè)化亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，所以應(yīng)用分子生物學(xué)的手段對(duì)菌種及其代謝途徑的改造就顯得非常有必要。目前通過(guò)基因工程和產(chǎn)氫代謝

2、調(diào)控手段改造產(chǎn)氫微生物是生物制氫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文以高效產(chǎn)氫細(xì)菌腸桿菌Enterobacter.spCN1為主要研究對(duì)象，對(duì)其產(chǎn)氫代謝途徑中的相關(guān)基因進(jìn)行了以下研究：從甲酸代謝產(chǎn)氫途徑考慮，利用基因工程和代謝工程來(lái)阻斷菌株Enterobacter.spCN1中產(chǎn)氫競(jìng)爭(zhēng)代謝從而提高產(chǎn)氫量。乳酸是腸桿菌Enterobacter.spCN1厭氧發(fā)酵丙酮酸代謝產(chǎn)氫的主要副產(chǎn)物。首先構(gòu)建乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenaseLDH

3、)基因敲除片段，然后通過(guò)運(yùn)用噬菌體λRed同源重組方法，獲得了乳酸脫氫酶基因缺失重組菌株。CN1△ldhA工程菌利用葡萄糖產(chǎn)氫比野生菌CN1的產(chǎn)氫量增加17.3%，在利用丙酮酸鈉和甘油產(chǎn)氫時(shí)比野生菌CN1的產(chǎn)氫量增加18.1%和增加1.8倍。從NADH途徑產(chǎn)氫途徑考慮，通過(guò)阻斷NADH的消耗，提高NADHNAD進(jìn)而提高產(chǎn)氫。通過(guò)運(yùn)用同源重組方法分別構(gòu)建乙醇脫氫酶(AlcoholdehydrogenaseAdh)缺失重組菌和延胡索酸還原酶

4、（fumaratereductase，F(xiàn)rd）缺失重組菌和NADH脫氫酶（NADHdehydrogenaseNuo）缺失重組菌。相對(duì)野生菌CN1的產(chǎn)氫量的變化為：CN1△adhE產(chǎn)氫減少41.3%，CN1△frd增加12.6%，CN1△Nuo增加21.4%。結(jié)合甲酸代謝產(chǎn)氫和NADH途徑產(chǎn)氫構(gòu)建了乳酸脫氫酶基因和延胡索酸還原酶雙缺失重組菌以及乳酸脫氫酶基因和NADH脫氫酶（NADHdehydrogenaseNuo）雙缺失重組菌。雙敲除菌

5、在厭氧生長(zhǎng)條件都受到一定的抑制，其中CN1△ldhA△frd的生長(zhǎng)被抑制程度更明顯一些。兩個(gè)雙敲除菌產(chǎn)氫量分別增加了32.5%和24.5%。說(shuō)明結(jié)合甲酸途徑產(chǎn)氫和NADH途徑產(chǎn)氫能夠進(jìn)一步提高產(chǎn)氫能力。最后對(duì)Enterobactersp.CN1產(chǎn)氫相關(guān)基因的進(jìn)行研究?？寺”岽x中非常關(guān)鍵的丙酮酸甲酸裂解酶及其激活酶基因和氫酶大小亞基基因并且構(gòu)建了共表達(dá)載體。并對(duì)氫酶大亞基基因進(jìn)行了敲除實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了氫酶大亞基在產(chǎn)氫過(guò)程是一種關(guān)鍵的酶。