26278.導(dǎo)入nifa基因的大豆根瘤菌工程菌株的構(gòu)建及其對固氮作用的影響

1、中文摘要。Dc3sS7中文摘要根瘤菌中固氮基因nifa是最重要的正調(diào)節(jié)基因，該基因表達(dá)的蛋白能促使固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifH、nifO、nifK表達(dá)。采用分子生物學(xué)及基因工程手段增加nifa基因的額外拷貝數(shù)，構(gòu)建高效固氮根瘤菌工程菌株，接種后與豆科植物共生，為植物提供生長所需要的部分氮素，使其免受外部惡劣環(huán)境的影響。本研究以快生型大豆根瘤菌(SinorhizobiumfreaiO15067的基因組DNA為模板，采用同源序列克隆法，分別克隆固

2、氮基因以弘全長以及帶有自身啟動子和終止子的砷么全長序列(Pni種nil_A)。生物信息學(xué)分析表明，該序列與RhizobiumspNGR234aplasmid的n／fa基因核苷酸序列有高達(dá)96％的相似性，推測該序列為快生型大豆根瘤菌15067的刀弘基因，該基因全長1671bp，編碼556個氨基酸，喲么基因自身的啟動子就在focC基因與以弘基因之間。采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建兩種不同啟動子控制下行弘基因表達(dá)的表達(dá)載體pTRPI∽一nifA，p

3、TRP姚nifA。采用三親本雜交的方式，將構(gòu)建成功的兩種表達(dá)載體及空載體pTRl02分別轉(zhuǎn)化土著大豆根瘤菌(SFH)和快生型大豆根瘤菌15067(SF)中，通過菌株的抗性篩選及發(fā)光性檢測，構(gòu)建四株轉(zhuǎn)基因根瘤茵工程菌株SFH(pTRPl∞面趴)，SFH(pTRPnifAnifA)，SF(pTRPI∞一nifA)，SF(pTRPni衍lifA)以及兩株轉(zhuǎn)空載體的根瘤菌工程菌株SFH(pTRl02)，SF(pTRl02)。以luxAB為報告基

4、因進(jìn)行外源重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的探究。在自生條件下，重組質(zhì)粒pTRPmnifA，pTRPnifAllifA及空載體pTRl02的保持率分別為100％，均能在土著大豆根瘤菌和快生型大豆根瘤菌15067中穩(wěn)定存在；共生條件下，接種轉(zhuǎn)基因工程菌的供試大豆根瘤發(fā)光活性檢測結(jié)果分別為100％，重組載體pTRPI∞一nifA，pTRPnifAllifA及空載體pTRl02均能在土著大豆根瘤菌和快生型大豆根瘤菌15067中穩(wěn)定遺傳。通過盆栽實驗結(jié)果表明：四

5、株轉(zhuǎn)基因根瘤菌工程菌株侵染大豆幼苗后，對大豆植株高度、鮮重、干重、根瘤個數(shù)等方面的影響與出發(fā)菌相比均存在不同程度黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文的差異。其中根瘤菌工程菌株SFH(pTRPla。nifA)，SFH(pTRPni價面fA)與土著大豆根瘤菌相比，在大豆在植株高度，根瘤的個數(shù)及大豆產(chǎn)量方面差異極顯著，根瘤個數(shù)增加2486％，2597％。根瘤菌工程菌株SF(pTRP!∽面fA)，SF(pTRPn凇面fA)與快生型大豆根瘤菌15067相比，在