家蠶Hippo通路成員的全基因組鑒定與分析.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）屬鱗翅目蠶蛾科昆蟲，是迄今唯一被人類完全馴化并大規(guī)模飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)昆蟲。家蠶具有生長(zhǎng)周期短、遺傳背景清楚、蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)、絲蛋白高效合成和分泌能力、飼養(yǎng)成本低和可規(guī)模化飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是繼果蠅之后的重要模式昆蟲之一。隨著家蠶全基因組序列的測(cè)定，在基因組水平上加快鑒定和解析家蠶重要經(jīng)濟(jì)性狀和生物學(xué)性狀相關(guān)基因，對(duì)于進(jìn)一步提升家蠶作為鱗翅目昆蟲模式的研究?jī)r(jià)值，促進(jìn)以基因改造利用為主線的蠶品種改良和新型遺傳素材創(chuàng)制

2、等具有深遠(yuǎn)意義。
　　器官大小是多細(xì)胞生物體的重要生物學(xué)性狀，對(duì)于一些經(jīng)濟(jì)動(dòng)物而言，器官大小還決定著其產(chǎn)量或品質(zhì)性狀。Hippo通路是迄今發(fā)現(xiàn)的一條控制動(dòng)物器官大小的主要信號(hào)通路。自1995年在果蠅中發(fā)現(xiàn)Hippo通路以來(lái)，有關(guān)Hippo通路的研究取得了豐富進(jìn)展，同時(shí)也顯示了Hippo通路復(fù)雜而多樣的調(diào)控機(jī)制。
　　本論文以家蠶全基因組數(shù)據(jù)和芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)家蠶Hippo通路成員進(jìn)行全基因組鑒定，

3、并對(duì)核心成員BmHpo進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，取得的主要結(jié)果如下：
　　1.家蠶Hippo通路核心成員的鑒定與分析
　　利用序列同源比對(duì)方法，自家蠶中鑒定了四個(gè)Hippo通路核心成員BmHpo、BmMats、BmSav和BmWts，其中BmHpo和BmWts都含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，BmSav含有四個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，BmMats含有Mob1_phocein結(jié)構(gòu)域，這四個(gè)成員的蛋白結(jié)構(gòu)域與果蠅Hippo通路核心成員的蛋白

4、結(jié)構(gòu)域類似，表明其在功能或作用方式上亦類似。BmHpo在卵巢和馬氏管中的表達(dá)量相對(duì)較高，BmMats在脂肪體中表達(dá)量最高，BmWts和BmSav在變態(tài)發(fā)育階段的雌雄個(gè)體中具有類似的表達(dá)模式。
　　2.家蠶Hippo通路上游成員的鑒定與分析
　　利用序列同源比對(duì)方法，自家蠶中鑒定了49個(gè)上游成員。在47個(gè)具有組織表達(dá)信息的成員中，BmMop、BmJub、BmCrb、BmCi、BmSmurf、BmLft、BmMer為組織特異表達(dá)

5、基因；BmEx、BmZyx、BmFexL7、BmDpp、BmDlg、BmRassf、BmSTRIPAK、BmPP1、BmMop、Bmβ-cat、BmSlmb、BmDREF、BmCK2、Bm14-3-3、BmCsk等成員在卵巢或精巢中高量表達(dá)，推測(cè)他們可能參與調(diào)控家蠶精子及卵子的發(fā)生。同時(shí)這些高表達(dá)成員在絲腺組織中也有高量表達(dá)，暗示其可能在家蠶絲腺生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3.家蠶Hippo通路下游成員的鑒定與分析
　

6、　利用序列同源比對(duì)方法，自家蠶中鑒定了包括轉(zhuǎn)錄共激活因子BmYki在內(nèi)的10個(gè)下游成員，其中BmYki在卵巢和前、后部絲腺中表達(dá)量相對(duì)較高，BmCbt、BmBrm和BmWbp2在絲腺、精巢和卵巢中表達(dá)量較高，BmMad在精巢和脂肪體中的表達(dá)量最高，BmMor在體壁和脂肪體中表達(dá)量較高，BmTsh在前部絲腺和后部絲腺表達(dá)相對(duì)較高，BmHth在雌蠶的后部絲腺和雄蠶中表達(dá)量相對(duì)較高，BmSdBP在雌蠶的前部及后部絲腺表達(dá)量相對(duì)較高，BmSd在

7、雄蠶的脂肪體中相對(duì)表達(dá)較高。
　　BmYki蛋白含有兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，含有高度保守的色氨酸殘基，能特異識(shí)別并結(jié)合富含脯氨酸的蛋白基序和磷酸化的氨酸/色氨酸-脯氨酸肽段。另外9個(gè)下游成員的蛋白結(jié)構(gòu)域與果蠅中的相應(yīng)下游成員類似，推測(cè)家蠶Hippo通路下游成員在通路中的功能或作用方式與果蠅類似，即BmYki作為最關(guān)鍵的下游成員，在調(diào)控下游靶基因表達(dá)過(guò)程中起核心作用，BmSd、BmTsh、BmHth、BmMad、BmCbt、BmBrm、Bm

8、Mor、BmWbp2和BmSdBP等9個(gè)成員通過(guò)與BmYki結(jié)合，協(xié)同BmYki入核調(diào)控下游靶基因。
　　4.家蠶Hippo通路核心成員BmHpo的克隆及表達(dá)分析
　　利用RT-PCR技術(shù)對(duì)家蠶Hippo通路核心基因BmHpo進(jìn)行了擴(kuò)增和克隆。BmHpo基因的CDS序列全長(zhǎng)1479 bp，編碼492個(gè)氨基酸；BmHpo基因編碼的蛋白含有一個(gè)Hpo家族共有的Ster I-20 family S保守結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示Bm

9、Hpo定位在細(xì)胞質(zhì)中，與果蠅和哺乳動(dòng)物中Hpo基因的定位結(jié)果一致。組織和時(shí)期轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析表明，BmHpo基因在家蠶各組織中的表達(dá)水平較低，在精巢和頭部表達(dá)量相對(duì)較高；其在家蠶整個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量普遍較低，這與Hippo通路屬于細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性信號(hào)通路吻合。
　　5.三種CRISPR/Cas系統(tǒng)的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄表達(dá)驗(yàn)證
　　根據(jù)從Addgene共享質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫(kù)下載的三種CRISPR/Cas系統(tǒng)的相應(yīng)序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成了帶有入核信號(hào)

10、的SpCas9、SaCas9和AsCpf1基因序列以及相應(yīng)的gRNA表達(dá)載體序列，構(gòu)建了以家蠶肌動(dòng)蛋白Actin4（A4）為啟動(dòng)子的3個(gè)Cas表達(dá)載體pUC57[A4-SpCas9-Ser1pA]、pUC57[A4-SaCas9-Ser1pA]和pUC57[A4-AsCpf1-Ser1pA]。細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，SpCas9、SaCas9和AsCpf1基因在家蠶BmE細(xì)胞中均有較高水平的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表明其具有應(yīng)用于家蠶基因組編輯的潛