香蕉SOD基因家族的全基因組鑒定及功能分析.pdf

1、香蕉是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟和糧食作物。但在生產(chǎn)上，易受冬春季低溫和夏季干旱等不利環(huán)境的影響，而導致植株生長發(fā)育受阻或減產(chǎn)，給蕉農(nóng)造成較大經(jīng)濟損失。逆境脅迫往往誘導植物細胞內(nèi)活性氧自由基的過量積累，進而產(chǎn)生氧化脅迫，影響植物的生長發(fā)育和結(jié)果。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能有效的清除活性氧并減輕氧化脅迫從而提高植物對逆境的耐受能力。已有研究表明香蕉SOD同工酶譜和酶活性

2、在低溫等非生物脅迫下發(fā)生顯著改變，說明SOD與香蕉抗逆境過程密切相關(guān)。但目前對香蕉SOD基因及其表達的調(diào)控機制還知之甚少。因此，本研究以兩個野生蕉的全基因組序列為參考，在栽培香蕉中對SOD基因家族進行系統(tǒng)的克隆鑒定，分析不同成員的啟動子序列和順式調(diào)控元件，對不同SOD基因成員在非生物脅迫和激素處理下的表達調(diào)控進行研究，以探討SOD在香蕉抗逆過程中的作用。主要研究結(jié)果如下：
　　1.香蕉SOD基因家族的全基因組分析與克隆
　　

3、①采用計算機分析方法從小果野蕉DH-Pahang（Musa acuminata, AA genome）的全基因組中共檢索到15條SOD候選序列，其中2條為冗余序列。從野蕉PKW（Musa balbisiana, BB genome）的全基因組中共檢索到14條SOD候選序列，其中1條為冗余序列，2條為嵌合基因。
　?、诟鶕?jù)兩個野生蕉的SOD序列設(shè)計引物，以福建天寶蕉（Cavendish banana, AAA genome）為材料，

4、共克隆得到25條不同的SOD mRNA轉(zhuǎn)錄本。它們分別由6個Cu/ZnSOD基因、4個MnSOD基因和2個FeSOD基因轉(zhuǎn)錄?？勺兗艚印⒖勺冝D(zhuǎn)錄起始位點和3’UTR選擇性多聚腺苷酸化是導致MaSOD基因mRNA多樣性的原因。
　　③以DNA為模板，克隆了12個MaSOD家族基因的gDNA序列，大小為1807~4720 bp。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)不同分為4組：MaCSD1A、MaCSD1B、MaCSD1C和MaCSD1D共4個成員為Ia組，

5、均含有6個內(nèi)含子。MaCSD2A和MaCSD2B構(gòu)成Ib組，均含有7個內(nèi)含子。4個MnSOD（MaMSD1A、MaMSD1B、MaMSD1C和MaMSD1D）組成II組，均含有5個內(nèi)含子。III組包含MaFSD1A和MaFSD1B共2個成員，但它們的外顯子數(shù)目存在差異；MaFSD1A含有7個內(nèi)含子，而MaFSD1B含有8個內(nèi)含子。該分類結(jié)果與MaSOD家族基因氨基酸序列的聚類結(jié)果及根據(jù)它們保守基序的分類結(jié)果一致。
　?、芪锓N內(nèi)和物

6、種間的共線性分析結(jié)果表明，全基因組復制和染色體區(qū)段復制是香蕉SOD基因家族數(shù)量擴張的主要因素。
　?、輰Σ煌蚪M類型香蕉SOD家族基因的比較分析結(jié)果表明，福建天寶蕉（AAA genome）的SOD基因與福州野生蕉（AA genome）和小果野蕉DH-Pahang（AA genome）的SOD基因有較高的一致性，但與野蕉PKW（BB genome）的SOD基因的一致性較低。
　　2.香蕉SOD基因家族編碼蛋白的生物信息學分析

7、
　　根據(jù)生物信息學分析結(jié)果，香蕉SOD家族基因編碼的蛋白與其他植物SOD具有很高的同源性，且都含有SOD保守結(jié)構(gòu)域和特征氨基酸位點，說明他們在進化上較為保守，在功能上具有相似性。但不同MaSOD蛋白仍存在各自的特點。MaSOD蛋白家族的分子量大小在15037.6~34235.5 Da，其中FeSOD的分子量最大，MnSOD的分子量次之，Cu/ZnSOD的分子量最小。除了MaMSD1C為堿性蛋白，MaCSD2B和MaMSD1A為弱

8、堿性蛋白外，其余的成員均為酸性蛋白。除了MaFSD1A為不穩(wěn)定蛋白外，其余的11個成員均為穩(wěn)定蛋白。除了MaCSD2A和MaCSD2B為疏水性蛋白外，其余的均為親水性蛋白。MaCSD1的4個蛋白（MaCSD1A、MaCSD1B、MaCSD1C和MaCSD1D）由19種氨基酸組成，都不含有色氨酸；其余的MaSOD家族蛋白均由20種氨基酸組成。亞細胞定位分析顯示4個MaCSD1蛋白（MaCSD1A、MaCSD1B、MaCSD1C和MaCSD

9、1D）定位于細胞質(zhì)；2個MaCSD2蛋白（MaCSD2A和MaCSD2B）定位于葉綠體；4個MaMSD蛋白（MaMSD1A、MaMSD1B、MaMSD1C和MaMSD1D）定位于線粒體；而MaFSD1A主要定位于葉綠體，在細胞質(zhì)中也存在，MaFSD1B則主要定位于葉綠體。磷酸化位點預(yù)測分析結(jié)果表明不同MaSOD蛋白成員間的各種磷酸化位點的數(shù)量和位置存在明顯差異，說明香蕉MaSOD家族的不同蛋白成員可能在翻譯后水平受不同的磷酸化方式調(diào)控表

10、達。
　　3.香蕉SOD基因家族啟動子的克隆與分析
　　采用PCR法直接克隆得到MaSOD家族的11條大小在1084~2114 bp的5’端調(diào)控序列。序列分析顯示，它們不僅包含核心啟動子區(qū)和啟動子核心元件TATA-box和CAAT-box，還含有大量與光響應(yīng)、環(huán)境脅迫應(yīng)答、激素響應(yīng)和生理節(jié)律調(diào)控等相關(guān)的順式元件。對MaSOD基因家族不同成員的啟動子順式元件的比較分析表明，不同成員的啟動子間除了都含有各自特異的順式元件外，還具

11、有一些共有的順式元件以及響應(yīng)同一脅迫的不同順式元件。說明在一定程度上，同一脅迫可以調(diào)控多個香蕉SOD成員的表達，但各個成員在響應(yīng)同一脅迫上又具有一定的差異性。
　　4.香蕉SOD基因家族在非生物脅迫和激素處理下的表達分析
　　qRT-PCR法分析MaSOD基因家族在不同組織部位的表達情況，結(jié)果表明除了MaCSD2B基因在假莖中未檢測到表達外，其余的11個成員在葉、假莖和根中都有表達。
　　qRT-PCR法分析MaSOD

12、基因家族在低溫、高溫、干旱和NaCl脅迫下的表達模式。結(jié)果表明香蕉MaSOD基因在不同非生物脅迫下，并非是簡單的一對一響應(yīng)，而是存在較為復雜的綜合響應(yīng)。具體情況如下：在低溫脅迫48 h時，香蕉MaCSD2A基因顯著上調(diào)表達，而MaCSD1D和MaCSD2B則顯著下調(diào)表達，其余成員的表達差異不明顯。在高溫脅迫48 h時，有6個基因（MaCSD1B、MaCSD1D、MaMSD1A、MaMSD1B、MaMSD1C和MaFSD1A）呈現(xiàn)顯著上調(diào)

13、表達，只有MaCSD2A基因在12 h時顯著下調(diào)表達。而在干旱脅迫下，只有3個Cu/ZnSOD基因（MaCSD1B、MaCSD1C和MaCSD2A）在不同的時間點顯著上調(diào)表達；其余的成員多數(shù)表達量呈現(xiàn)下調(diào)，其中5個成員（MaCSD1A、MaCSD1D、MaMSD1A、MaMSD1B和MaFSD1B）表達量的下調(diào)倍數(shù)達2~10倍。高鹽脅迫顯著誘導MaCSD1D、MaMSD1A和MaMSD1B基因的表達，但抑制MaCSD2A和MaFSD1B

14、基因的表達。
　　qRT-PCR法分析MaSOD基因家族在脫落酸、赤霉素、生長素和水楊酸4種激素處理下的表達模式。結(jié)果表明只有 MaCSD和 MaMSD亞家族的成員被顯著誘導表達，而 MaFSD亞家族的成員表達量變化不明顯。具體情況如下：在脫落酸處理下，MaCSD1D和MaMSD1A被誘導顯著上調(diào)表達。在赤霉素處理后，也僅有2個基因（MaCSD1D和MaMSD1A）在不同時間點顯著上調(diào)表達，其他成員的表達差異不顯著。生長素處理則可

15、誘導3個MaCSD基因（MaCSD1A、MaCSD1D和MaCSD2B）和1個MaMSD基因（MaMSD1A）在不同時間點顯著上調(diào)表達。而水楊酸處理24 h時顯著誘導MaCSD1D的上調(diào)表達。
　　5.香蕉銅鋅超氧化物歧化酶MaCSD1D基因的功能分析
　　細胞質(zhì)型的MaCSD1D基因在非生物脅迫（冷、熱、干旱和鹽脅迫）和激素處理（ABA、GA3、IAA和 SA）下均有顯著的上調(diào)或下調(diào)表達，暗示該基因可能在香蕉的逆境脅迫中發(fā)

16、揮重要作用。為了進一步揭示其功能，構(gòu)建 MaCSD1D基因的過表達載體并轉(zhuǎn)化煙草，對MaCSD1D基因在低溫脅迫下的功能進行分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)MaCSD1D基因的煙草種子在低溫下的萌發(fā)速度和生長狀況均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因煙草的種子。6片功能葉時期的轉(zhuǎn)基因煙草比非轉(zhuǎn)基因煙草對低溫脅迫表現(xiàn)出更強的耐受能力，且轉(zhuǎn)基因煙草在低溫下的SOD酶活性高于非轉(zhuǎn)基因煙草的SOD酶活性。
　　6.香蕉Cu/ZnSOD分子伴侶蛋白基因MaCCS的克隆與表達分析<

17、br>　　銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）是一種同時含銅和鋅的金屬酶，在正常生理條件下銅的獲取需要通過分子伴侶蛋白CCS來實現(xiàn)。本研究采用RT-PCR結(jié)合RACE-PCR獲得了1條新的CCS基因（MaCCS）。序列分析表明MaCCS具有典型的CCS結(jié)構(gòu)域和保守的基因結(jié)構(gòu)。MaCCS基因啟動子上存在大量參與非生物脅迫和激素應(yīng)答的順式元件。qRT-PCR分析表明MaCCS基因在葉、假莖和根部均有表達，并參與非生物脅迫（CuSO4、熱、

18、冷和干旱）和激素（ABA和IAA）應(yīng)答。而且，MaCCS基因的轉(zhuǎn)錄模式在低溫脅迫下與MaCSD1B、MaCSD1D和MaCSD2B基因的相似，在熱脅迫下與MaCSD1B和MaCSD1D基因的相似，在干旱脅迫下與MaCSD1B和MaCSD1C基因的相似，在ABA和IAA處理下則與MaCSD1A、MaCSD1C和MaCSD2B基因的相似。這說明在非生物脅迫和激素處理下，香蕉MaCCS基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達與其對應(yīng)的MaCSD基因的表達呈現(xiàn)正相