TLR3、7配體增強(qiáng)PRRS滅活疫苗免疫應(yīng)答及PRRSV感染MoDCs的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS）是由PRRS病毒（Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV）引起的豬的一種繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)傳染病，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和產(chǎn)木乃伊胎，仔豬表現(xiàn)為呼吸障礙。PRRS已成為全球養(yǎng)豬業(yè)中最嚴(yán)重的疾病之一，我國(guó)于1996年首次發(fā)現(xiàn)此病，PRRS給我國(guó)

2、養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失。
　　目前，防治PRRS的常用方法是接種疫苗，市場(chǎng)上常用的PRRS疫苗主要有減毒活疫苗（Modified live vaccine，MLV）和滅活疫苗（Inactivated vaccine，IV），減毒活疫苗保護(hù)性好，但因RNA病毒變異頻繁導(dǎo)致疫苗具有很強(qiáng)的毒株特異性，且存在病毒基因重組和毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。滅活疫苗安全性好，但不能誘導(dǎo)足夠的細(xì)胞免疫，也不能提供足夠的保護(hù)力，亟需有效的疫苗佐劑增強(qiáng)其免疫反應(yīng)。

3、
　　樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCs）是功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，其表面表達(dá)許多模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRR），DCs能夠識(shí)別捕獲并加工處理抗原，將其遞呈給體內(nèi)初始型T細(xì)胞，引起T細(xì)胞的分化，從而將先天性免疫和獲得性免疫聯(lián)系起來。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是表達(dá)于DCs表面的一類重要的PRR，可特異性識(shí)別病原相關(guān)分子模式

4、（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），啟動(dòng)下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起炎性細(xì)胞因子、I型干擾素、趨化因子和抗菌肽的分泌，激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞直接殺傷病原體，在先天性免疫防御和獲得性免疫防御中起重要作用。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)于研究生命活動(dòng)規(guī)律，闡明疾病機(jī)理及找尋疾病的早期分子標(biāo)志有重要意義。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用日益廣泛，其研究方法也不斷更新。2004年，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公

5、司推出了新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)同位素相對(duì)標(biāo)記和絕對(duì)定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）。該技術(shù)具有定量敏感、反應(yīng)迅速、標(biāo)記完全、重復(fù)性高、高通量、定性定量同時(shí)進(jìn)行的特點(diǎn)，已在微生物、動(dòng)植物、神經(jīng)組織等領(lǐng)域有所應(yīng)用。
　　1、TLR3、7配體與PRRSV滅活抗原不同組合感染MoDCs的試驗(yàn)
　　本試驗(yàn)將TLR3配體poly(I:C)及T

6、LR7配體imiquimod與PRRSV滅活抗原不同組合孵育MoDCs。我們首先運(yùn)用real time PCR的方法，對(duì)各組細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子和Th2型細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定，然后ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清中Th1型細(xì)胞因子與Th2型細(xì)胞因子的蛋白分泌量。結(jié)果顯示，poly(I:C)-imiquimod-PRRSV滅活抗原孵育組中，Th1型細(xì)胞因子與Th2型細(xì)胞因子mRNA及蛋白的表達(dá)量顯著高于其他各組（P<0.05）。<

7、br>　　為了闡明TLR3、7配體增強(qiáng)MoDCs對(duì)PRRSV滅活抗原的免疫應(yīng)答機(jī)制，我們檢測(cè)各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)TLR信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)分子的TRIF、MyD88及NF-κB P65 mRNA水平及各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)中細(xì)胞質(zhì)蛋白TRIF、MyD88及磷酸化-IκBα和細(xì)胞核蛋白中NF-κB P65的蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，與PRRSV滅活抗原孵育組相比，poly(I:C)-imiquimod-PRRSV滅活抗原孵育組中TRIF、MyD88及

8、NF-κB P65的mRNA水平在8 h都顯著升高，細(xì)胞質(zhì)蛋白中TRIF、MyD88及磷酸化-IκBα的蛋白表達(dá)量在8 h和12 h均有明顯升高，細(xì)胞核蛋白中NF-κB P65的蛋白水平呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，其他各組均未能引起通路下游NF-κB P65和磷酸化-IκBα表達(dá)量的變化。同時(shí)，NF-κB抑制劑BAY11-7082預(yù)處理poly(I:C)-imiquimod-PRRSV滅活抗原孵育組細(xì)胞后，其細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量回落到本底水

9、平，由此實(shí)驗(yàn)可知，協(xié)同使用poly(I:C)、imiquimod及PRRSV滅活抗原激活了MoDCs中TRIF/MyD88-NF-κB信號(hào)通路并由此引起了細(xì)胞因子的分泌，其中NF-κB對(duì)細(xì)胞因子的分泌起到了關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。
　　另外，流式細(xì)胞儀對(duì)各處理組MoDCs吞噬PRRSV的能力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，TLR3、7配體能夠增強(qiáng)MoDCs的吞噬能力，且poly(I:C)、imiquimod合用的增強(qiáng)效果最顯著（P<0.05）。<

10、br>　　2、TLR3、7配體與PRRSV滅活抗原不同組合免疫小鼠的試驗(yàn)
　　小鼠免疫試驗(yàn)中，我們將TLR3、7配體與PRRSV滅活抗原不同組合后免疫小鼠，結(jié)果顯示，poly(I:C)-imiquimod-PRRSV滅活抗原免疫組小鼠中淋巴細(xì)胞增殖及脾淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞的百分含量顯著高于其他各組（P<0.05）。Poly(I:C)與imiquimod合用作為佐劑免疫后的小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞既能夠顯著促進(jìn)Th1型T細(xì)胞

11、的增殖又可顯著促進(jìn)Th2型T細(xì)胞的增殖（P<0.05）。poly(I:C)-imiquimod-PRRSV滅活抗原免疫組小鼠血清中Th1型細(xì)胞因子和Th2型細(xì)胞因子的濃度及血清中和抗體滴度顯著高于其他各組（P<0.05）。
　　3、高致病性PRRSV SD-JN感染MoDCs蛋白質(zhì)組學(xué)分析試驗(yàn)
　　iTRAQ試驗(yàn)共檢測(cè)到252個(gè)表達(dá)變化差異顯著的蛋白（P≤0.05且ratios≥1.5-fold或ratios≤0.67）。對(duì)

12、此差異蛋白進(jìn)行了GO分析、KEGG通路分析和COG分析。結(jié)果顯示，所有差異顯著變化蛋白中與PRRSV受體相關(guān)的波形蛋白（vimentin）和清道夫受體（CD163）的表達(dá)量顯著變化。與內(nèi)吞（endocytosis）clathrin依賴途徑中的clathrin相關(guān)蛋白如clathrin重鏈蛋白（clathrin heavy chain，CLTC），clathrin輕鏈蛋白（clathrin light chain，CLTA），磷脂酰肌醇結(jié)

13、合網(wǎng)格蛋白（phosphatidylinositol-binding clathrin assembly protein，PICALM）和apetela2蛋白（AP2）的表達(dá)量顯著升高。與抗原遞呈有關(guān)的MHC II類分子SLA-DR的表達(dá)量顯著升高。與JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白及其下游因子中的STAT1、Mx1、Mx2和OAS2的表達(dá)量顯著升高。與actin細(xì)胞骨架有關(guān)的支架蛋白（Ras GTPase-activating-lik

14、e protein，IQGAP）包括IQGAP1和IQGAP2的表達(dá)量顯著下降。我們用western blot的方法對(duì)PICALM、STAT1和Mx1蛋白的變化進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與iTRAQ分析結(jié)果一致。為了更好地了解PRRSV與MoDCs的相互作用，我們用STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins）軟件對(duì)變化差異顯著蛋白的相互關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)