膦氧氮丙啶對紅耳龜雄性不育效應(yīng)及其作用機制的初步研究.pdf

1、紅耳龜（Trachemys scripta elegans）是世界最危險的100個入侵物種之一，是典型的外來有害物種，現(xiàn)已證實紅耳龜能在我國臺灣、海南、廣東等地的野外成功繁殖，其繁殖力、存活率遠(yuǎn)大于我國本土龜類。由于紅耳龜生性活潑、色彩艷麗、極易飼養(yǎng)等特性倍受養(yǎng)殖戶青睞。2009年，國內(nèi)養(yǎng)殖場年產(chǎn)量超過5000萬只，每年從國外進(jìn)口的量約800萬只，并銷售到國內(nèi)外各市場。如此龐大的養(yǎng)殖規(guī)模，運輸和管理過程中因疏漏導(dǎo)致的逃逸現(xiàn)象在所難免，更

2、為嚴(yán)重的是紅耳龜成為大多數(shù)人選擇放生的對象。由于寵物丟棄、宗教放生、養(yǎng)殖逃逸，甚至執(zhí)法人員誤把紅耳龜當(dāng)成保護(hù)物種放生等各種因素，導(dǎo)致紅耳龜在我國野外廣泛存在，對我國自然生態(tài)系統(tǒng)將產(chǎn)生嚴(yán)重影響。令人擔(dān)憂的是到目前為止這種狀況不但沒有改觀，還有發(fā)展的趨勢。如何有效控制紅耳龜在入侵地的蔓延，國內(nèi)外對該物種有效防治方法的研究尚未見報道，因此，對其防治方法開展研究十分必要。
　　基于不育防治技術(shù)在蟲害和鼠害方面取得的巨大成功，我們提出將不育

3、防治技術(shù)應(yīng)用于外來物種紅耳龜?shù)姆揽?，從生態(tài)學(xué)、生物學(xué)角度考慮，不育防治技術(shù)是一項治本的措施。通過對養(yǎng)殖場出售的紅耳龜個體進(jìn)行售前的不育處理，將有效阻止逃逸、放生個體參與野外種群的繁殖，并可能干預(yù)野外可育個體的繁殖，從而起到有效控制該物種在野外迅速蔓延的態(tài)勢。經(jīng)過對大量有關(guān)不育劑資料的查閱篩選及預(yù)實驗，本研究以不育劑膦氧氮丙啶（MAPO）對雄性紅耳龜?shù)牟挥?yīng)為主題，采用腹腔注射的方法，1）通過檢測臟器系數(shù)、睪丸體積，石蠟組織切片及圖像處

4、理軟件（Motic Images Advanced3.2）測量曲細(xì)精管等，研究MAPO影響雄性紅耳龜生殖功能的有效性；2）通過雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測激素、抗氧化酶、標(biāo)志酶的變化，初步探討其不育作用機制；3）在產(chǎn)精期，通過檢測紅耳龜?shù)牟G丸、附睪臟器系數(shù)、激素以及制作組織切片，研究其不育可逆性。以期探尋野外紅耳龜?shù)姆乐涡峦緩?，為外來物種紅耳龜?shù)姆乐翁峁┛茖W(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、MAPO對雄性紅耳龜不育效

5、應(yīng)研究
　　選用健康、成體雄性紅耳龜（BW:738.9±101.2g，n=160）進(jìn)行實驗，隨機均分為4組，即對照組、低、中、高劑量組，每組40只。根據(jù)預(yù)實驗，采用腹腔注射法，低、中、高劑量組每次分別注射2ml濃度為0.1g/L、3g/L、10g/L的MAPO鹽溶液，對照組則注射同等劑量的0.65％生理鹽水，每3天注射一次，共處理15d。一般體征觀察：低、中劑量組紅耳龜行動敏捷，健康活潑，平均攝食量與對照組基本一致，存活率為100

6、%。高劑量組平均攝食量下降，處理前后體重?zé)o明顯變化，但存活率為0%。這表明中劑量（3g/L，15d）及以下處理對雄性紅耳龜生長無影響，而高劑量組（10g/L，15d）劑量高于成體雄性紅耳龜?shù)淖畲竽褪軇┝浚↙D0），導(dǎo)致高劑量組個體死亡，建議進(jìn)一步擴(kuò)大試驗，做半致死劑量（LD50）測試。
　　與對照組相比，各處理組附睪、腎臟、肝臟、心臟臟器系數(shù)均無明顯差異。低劑量組睪丸臟器系數(shù)（0.17±0.07）和體積（4.63±0.52mL）與

7、對照組無顯著差異，中、高劑量組睪丸臟器系數(shù)（0.06±0.02、0.08±0.03）則明顯低于對照組（0.15±0.07），其體積（1.83±0.18mL、2.01±0.54mL）也顯著低于對照組（4.22±0.73mL），約為對照組的1/2，提示睪丸是MAPO對雄性紅耳龜作用的效應(yīng)器官。經(jīng)組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，各處理組附睪、腎臟并未發(fā)生病變，唯高劑量組肝臟組織略有空泡化。對照組曲細(xì)精管中生精上皮排列有序，由外向內(nèi)依次可見精原細(xì)胞、初級精

8、母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞，生精上皮厚度為（80.46±6.87μm）。低劑量組生精上皮排列松散，次級精母細(xì)胞及精子細(xì)胞脫落進(jìn)入管腔，生精上皮厚度為（71.60±21.61μm），與對照組無顯著差異，表明低劑量（0.1g/L，15d）對雄性紅耳龜無顯著的不育效應(yīng)。而中、高劑量組生殖細(xì)胞層數(shù)減少變薄，幾乎全部退化，生精上皮厚度分別為（9.67±8.67）μm和（4.30±2.29）μm，約為對照組的1/10和1/20，與對照組相比差異顯著，僅見

9、一層支持細(xì)胞靠近基底膜，間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育良好，偶見集群增生，表明MAPO對雄性紅耳龜具有明顯的不育效應(yīng)，它能穿透血—睪屏障，損壞各級生殖細(xì)胞，阻礙精子的產(chǎn)生，引起不育。
　　2、MAPO對雄性紅耳龜不育作用機制初步研究
　　與對照組相比，各處理組血清和睪丸中促性腺激素（FSH、LH、PRL）、性激素（T、E）含量均無顯著差異，表明MAPO對雄性紅耳龜生殖調(diào)節(jié)系統(tǒng)下丘腦—垂體—性腺軸（HPT）無影響，推測 MAPO對雄性紅耳龜?shù)恼?/p>

10、常發(fā)情及性活動無影響。中、高劑量組睪丸標(biāo)志酶LDH（4.71±0.10U/L、4.64±0.12U/L）、ALP（142.87±1.99U/L、140.55±3.66U/L）顯著低于對照組，LDHx（4.19±0.13U/L、4.16±0.06U/L）非常顯著低于對照組（4.98±0.11U/L）；抗氧化酶 SOD（88.65±3.02U/L、90.15±3.04U/L）顯著低于對照組（102.08±3.57U/L），GSH-Px（21

11、.89±2.39U/L、20.66±2.09U/L）顯著低于對照組（33.32±4.27U/L）。表明 MAPO破壞睪丸結(jié)構(gòu)，引起生殖細(xì)胞抗氧化酶活性降低，核酸代謝紊亂，相應(yīng)標(biāo)志酶活力下降，能量代謝受阻，是其可能的部分作用機制。
　　3、MAPO對雄性紅耳龜不育可逆性研究
　　停止注射30d，低劑量組睪丸臟器系數(shù)（0.18±0.02）和體積（1.14±0.13mL）與對照組大小基本一致。中劑量組睪丸臟器系數(shù)（0.07±0.0

12、2）明顯小于對照組（0.17±0.04），睪丸體積（0.58±0.05mL）也顯著小于對照組（1.52±0.51mL）。表明恢復(fù)30d時，中劑量組睪丸持續(xù)萎縮。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組與低劑量組曲細(xì)精管中生精上皮排列著較多的各級生殖細(xì)胞，由基底膜向腔內(nèi)依次排列著精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞、精子，管腔中精子數(shù)目較多，表明低劑量組具有正常的生精功能。而中劑量組曲細(xì)精管則空腔化，只存在支持細(xì)胞貼近基底膜。說明恢復(fù)30d時，

13、中劑量組不育個體并未恢復(fù)生精能力。停藥122d，低劑量組睪丸臟器系數(shù)（0.14±0.02）和體積（1.51±0.21mL）與對照組無明顯差異，附睪臟器系數(shù)（0.06±0.01）與對照組也無顯著差異。而中劑量組睪丸臟器系數(shù)（0.08±0.01）明顯小于對照組（0.17±0.02），睪丸體積（0.66±0.07mL）明顯小于對照組（2.34±0.73mL），附睪臟器系數(shù)（0.03±0.00）也顯著低于對照組（0.07±0.01）。經(jīng)組織病理

14、學(xué)觀察，對照組與低劑量組睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)完整，并產(chǎn)生一定數(shù)目的精子，而中劑量組曲細(xì)精管則持續(xù)空腔化，只有貼于基底膜的支持細(xì)胞，并無精子；對照組與低劑量組附睪中存有大量精子，中劑量組附睪則空腔化，無精子。表明恢復(fù)122d時，中劑量組（3g/L，15d）不育個體并未恢復(fù)生殖力，提示該處理濃度及處理時長可引起成體雄性紅耳龜不可逆的生精功能障礙。
　　綜上可知，MAPO對雄性紅耳龜具有明顯的不育效應(yīng)，能穿透血—睪屏障，引起生殖細(xì)胞抗氧化系

15、統(tǒng)紊亂，抗氧化酶及標(biāo)志酶活性降低，能量代謝受阻，損壞各級生殖細(xì)胞，阻礙精子產(chǎn)生，引起雄性紅耳龜不可逆的生殖障礙。濃度為3g/L MAPO經(jīng)腹腔注射處理15d既對其攝食量和體重?zé)o影響，又能引起不可逆的不育效應(yīng)，是應(yīng)用不育防治技術(shù)控制外來物種紅耳龜?shù)膮⒖紕┝俊１菊撐氖状翁岢鰧⒉挥乐渭夹g(shù)應(yīng)用于外來物種紅耳龜?shù)姆乐?，并首次研究了不育?MAPO對爬行動物的不育效應(yīng)，為紅耳龜不育防治技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定了理論基礎(chǔ)，拓展了不育防治技術(shù)控制有