三七病毒病病原種類鑒定及其相關(guān)病毒分子變異分析.pdf

1、三七是我國中藥材中的一顆明珠,具有非常重要的藥用和醫(yī)療保健價值。但因其特殊的生長、管理條件,很容易造成病毒病的發(fā)生,該病害的發(fā)生嚴重影響三七的生活力,降低三七的產(chǎn)量和質(zhì)量,對生產(chǎn)構(gòu)成嚴重的威脅。但到目前為止,有關(guān)三七病毒病的研究很少,而且現(xiàn)有的研究也僅僅停留在三七病毒病原物的鑒定層面上。植物病毒病被稱作是―植物的癌癥‖,防治植物病毒病最重要的工作首先就是要明確病毒病原物,然后才能通過分析各個病原物的傳播方式、寄主范圍及發(fā)生規(guī)律等方面防控

2、病毒病的發(fā)生。鑒于此,本文旨在通過對三七病毒病病原物開展進一步的鑒定研究,探明三七病毒中除三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)外的其他種類及優(yōu)勢種,明確其寄主范圍,確定病毒分離物/復(fù)合體與癥狀類型的相關(guān)性,為進一步深入開展相關(guān)病毒的致病性分子機理、病害的監(jiān)測和預(yù)報以及有效防控提供堅實的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo),并對國內(nèi)外該領(lǐng)域的相關(guān)研究工作起到一定的借鑒和推動作用。
　　本文以三七病葉為材料提取dsRNA及提純病毒,并嘗試

3、以dsRNA為模板構(gòu)建cDNA文庫得到可能的病毒種類,以三七病毒提純產(chǎn)物為材料通過電鏡技術(shù)和SDS-PAGE、質(zhì)譜分析技術(shù)分別進行病毒粒子形態(tài)觀察及可能的病毒種類初步鑒定。結(jié)果經(jīng)dsRNA、提純病毒及電鏡技術(shù)等再次驗證三七病樣除了PnVY之外還存在不止一種病毒病原物。而由于提取的dsRNA濃度過低,致使沒能成功完成對cDNA文庫的構(gòu)建。質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示三七病樣中可能存在大豆矮縮病毒(Soybean dwarf virus,SbDV),

4、但經(jīng)SbDV特異性引物檢測及序列分析,并未在該批三七病樣中檢測到SbDV。
　　應(yīng)用雙生病毒(geminiviruses)的基因組DNA及衛(wèi)星(betasatellite)的DNA檢測通用引物和中國番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus,TYLCCNV)的特異性引物,在三七病樣YWSh03中檢測到了的TYLCCNV和TYLCCNB,并獲得了 TYLCCNV和TYLCCNB的全長基因組

5、序列。然后將含有 TYLCCNV及TYLCCNB侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌懸液、菌落接種至三七葉片上,并且通過獲毒的粉虱對三七進行傳毒試驗。結(jié)果農(nóng)桿菌接種的三七苗都表現(xiàn)為黃化癥狀,而粉虱傳毒的三七苗癥狀不明顯,但通過PCR檢測均能檢測到TYLCCNV和TYLCCB。通過分子生物學(xué)和生物學(xué)的方法證實了TYLCCNV及TYLCCNB對三七的侵染,完成了柯赫氏法則的驗證,這是TYLCCNV及TYLCCNB侵染人參屬植物的首次報道。
　　以三七

6、病葉、dsRNA和病毒提純產(chǎn)物為接種材料,將其摩擦接種于供試植株中,接種一月之久,大部分寄主表現(xiàn)出褪綠黃化的癥狀,但經(jīng)RT-PCR檢測后,PnVY的寄主只有有茄科的黃煙、辣椒和豆科的豇豆。
　　對文山、紅河、昆明、曲靖等地的三七種植園進行了病害調(diào)查和相關(guān)病毒的檢測。發(fā)現(xiàn)三七病毒病的癥狀類型多樣,發(fā)病率逐年增加,且田間表現(xiàn)復(fù)合癥狀的居多。初步建立了PnVY和TYLCCNV的雙重PCR檢測體系,該體系能夠快速及時準確的對三七田間這兩種

7、病毒的發(fā)生開展檢測及分析。運用雙重 PCR檢測體系對不同地區(qū)三七病樣的PnVY和TYLCCNV的帶毒率進行檢測,發(fā)現(xiàn)由兩種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象較多,復(fù)合侵染率在38.7％~50.0%之間,且從整體來講,PnVY對三七的侵染率最高。
　　獲得了5個PnVY分離物的全基因組序列、6個TYLCCNV分離物基因組全序列及4個 TYLCCNB的基因組全序列,并對其進行基因組結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進化分析,推測三七病毒病復(fù)雜多樣的癥狀類型可能與TYLC