三七病毒病病原的初步研究.pdf

1、三七是我國重要的傳統(tǒng)大宗中藥材，由于其對(duì)生長環(huán)境條件的特殊要求，現(xiàn)僅生長于中國西南山區(qū)。近年，三七病毒危害十分嚴(yán)重?！　≡颇鲜∥纳街萑卟《静”憩F(xiàn)4種癥狀：葉脈皺縮黃化、葉片皺縮畸形、葉片褪綠黃化和葉片皺縮白綠花葉，將其編號(hào)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4組，通過生物學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)方法對(duì)其病毒毒原進(jìn)行初步鑒定?！　⊥ㄟ^機(jī)械摩擦方法接種鑒別寄主，得到4組三七樣品在9種鑒別寄主上較一致的癥狀。其中德伯尼煙表現(xiàn)葉片褪綠變褐；朝天椒頂枯；雙富大椒

2、幼葉畸形；千日紅葉片出現(xiàn)系統(tǒng)枯斑；洋酸漿心葉褪綠斑駁、植株矮化；昆諾阿藜、莧色藜接種葉產(chǎn)生局部枯斑。實(shí)驗(yàn)確定千日紅、朝天椒為較好的鑒別寄主；德伯尼煙、朝天椒為較好的繁殖寄主。　　ELISA分析顯示表現(xiàn)皺縮白綠花葉的Ⅳ號(hào)樣品與CMV(Cucumbermosaicvirus)ELISA檢測(cè)試劑呈弱陽性反應(yīng)，4組三七病樣及接種發(fā)病鑒別寄主德氏煙、朝天椒、曼陀羅、千日紅均與POTY(Potyvirus)ELISA檢測(cè)試劑有弱陽性反應(yīng)?！　?/p>

3、三七樣品和接種發(fā)病鑒別寄主樣品的病毒粗提純液用負(fù)染法制片，在電鏡下均觀察到線狀(700-830nm)和長線狀(1370-1928nm)直徑均約12nm的2種粒體。　　通過分子生物學(xué)檢測(cè)，表現(xiàn)皺縮白綠花葉的Ⅳ號(hào)樣品用CMV特異引物擴(kuò)增出目的條帶，克隆其CP基因并測(cè)序，將其CP基因核苷酸序列與其他CMV屬病毒的CP基因核苷酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明此序列與已發(fā)表的Cucumbermosaicvirus50多種分離物的外殼蛋白相應(yīng)區(qū)域基因序列

4、同源性均為98％，CP基因部分共654個(gè)核苷酸，編碼218個(gè)氨基酸，外殼蛋白分子量24kDa。這與血清學(xué)的檢測(cè)結(jié)果一致?！　∫员憩F(xiàn)葉片褪綠黃化的Ⅲ號(hào)樣品所提核酸為模板，用Potyvirus屬RACE引物2次擴(kuò)增后，共得到從3'端Poly(A)開始的3099bp的核苷酸序列，此時(shí)再利用第3對(duì)引物對(duì)序列繼續(xù)擴(kuò)增，預(yù)期位置沒有條帶出現(xiàn)。所得序列在GenBank中的BLAST結(jié)果與馬鈴薯Y病毒屬的胡蘿卜Y病毒(CarrotvirusY)、芹菜

5、花葉病毒(Celerymosaicvirus)、芹菜Y病毒(ApiumvirusY)CP基因序列中420-500bp的核苷酸同源性達(dá)到80％；與菜豆普通花葉病毒(Beancommonmosaic)、蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus)、菜豆黃花葉病毒(Beanyellowmosaic)、甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus)多聚蛋白基因序列中編碼NIb部分150左右核苷酸的同源性在85％左右?！　【C合幾