三角魴轉(zhuǎn)錄組分析與不同地理種群遺傳多樣性研究.pdf

1、三角魴(Megalobramaterminalis)，屬鯉科(Cyprinidae)、魴屬(Megalobrama)，主要分布在東南沿海，長江水系、黃河水系、黑龍江水系以及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，是魴屬中分布最廣泛的魚類。但野生三角魴資源量逐年減少，為了保護(hù)三角魴的野生資源，同時建立三角魴良種選育平臺，本實驗室以錢塘江三角魴原種為親本，建立了50個全同胞家系。F1代5月齡時，隨機(jī)在1個家系中選取200尾個體，測量體長體重后，分別選取體重的前5％

2、（10尾）個體的肌肉、肝臟和腦組織提RNA，各組織的RNA等量混合成1個樣品L，同樣分別選取體重的后5％（10尾）個體的肌肉、肝臟和腦組織提RNA，各組織的RNA等量混合成1個樣品S。L和S的總RNA提取mRNA后，本實驗室按照IonTorrent測序儀200bp讀長的轉(zhuǎn)錄組測序指南，構(gòu)建出L和S的cDNA文庫;制備318芯片后，經(jīng)本實驗室的IonTorrent測序儀測序。采用生物信息學(xué)方法比較分析三角魴F1代中L和S兩個轉(zhuǎn)錄組;利用微

3、衛(wèi)星搜索軟件搜索三角魴F1代轉(zhuǎn)錄組中的SSR序列，篩選出三角魴的分子標(biāo)記，用于三角魴不同地理種群的遺傳多樣性研究。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)依據(jù)IonTorrent測序儀200bp讀長的轉(zhuǎn)錄組測序指南和相關(guān)試劑盒，構(gòu)建了三角魴F1代L和S的cDNA文庫。經(jīng)檢測，L和ScDNA文庫濃度分別為5.06ng/μL和34.8ng/μL，均大于5ng/μL，符合IonTorrentRNA-Seq測序要求，文庫長度均約200bp，表明三角

4、魴F1代L和S的cDNA文庫構(gòu)建成功。
　　(2)利用318芯片，在IonTorrentPGMTM測序儀上測序，獲得了三角魴F1代L和S的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。其中，L和S分別獲得2，163，601個rawreads和3,893，877個rawreads。下機(jī)序列兩次去除引物、接頭及短序列后，L獲得1，987，905cleanedreads;S得到3，795，177cleanedreads。L所有cleanedreads成功拼接出27，67

5、3contigs，其中N50為156bp，平均長度為164bp(101bp-2，824bp);S所有cleanedreads成功拼接出78，370contigs，其中N50為152bp，平均長度為162bp(101bp-3，376bp)。與NR蛋白數(shù)據(jù)庫比對，L和S分別比對上15，786和38，923contigs，鑒定出10，800和21，718個uniqueprotein。GO注釋中，L和S分別有3486個contigs、7134個

6、contigs注釋上，這些contigs被分為三大生物類別。KEGG分析中，L有28個生長相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，S有117個生長相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。三角魴F1代轉(zhuǎn)錄組序列經(jīng)微衛(wèi)星搜索軟件搜索，L有118個微衛(wèi)星序列，S有383個微衛(wèi)星序列，L和S中可用于設(shè)計微衛(wèi)星引物的序列分別為46和143個。利用三角魴的SSR序列開發(fā)了81對微衛(wèi)星引物，最終篩選出2個可以穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的微衛(wèi)星位點。
　　(3)利用本實驗室開發(fā)的30個多態(tài)性較高的團(tuán)頭魴微

7、衛(wèi)星位點，在三角魴中跨種擴(kuò)增，篩選出能穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的位點13個，其中有11個位點在三角魴中具有多態(tài)性?；谌囚欈D(zhuǎn)錄組開發(fā)的2個微衛(wèi)星位點及跨種擴(kuò)增篩選出的11個微衛(wèi)星位點的觀測雜合度（Ho）與期望雜合度（He）的分布范圍分別為0.7000-0.9667和0.6480-0.8264;多態(tài)信息含量(PIC)為0.5710-0.7885，均大于0.5，表明這13個位點可用于三角魴遺傳多樣性研究。
　　(4)利用13個位點對三角魴

8、錢塘江、北江、金沙河水庫及黑龍江等4個群體分析遺傳多樣性。三角魴4個群體的平均有效等位基因數(shù)在4.0196與4.4093之間，觀測雜合度分布于0.4至0.9667之間，期望雜合度分布在0.6073到0.8661范圍內(nèi)。固定指數(shù)Fst的遺傳分化研究指出，北江群體與錢塘江群體、北江群體與金沙河群體間均存在中等程度的遺傳分化(0.05＜Fst＜0.25)。UPGMA聚類顯示錢塘江群體和黑龍江群體先聚為一類，再與金沙河水庫群體聚為一類，最后與北