轉(zhuǎn)TsVP提高玉米低磷耐受性的研究及不同玉米基因型低磷響應(yīng)mircoRNA的差異分析.pdf

1、磷是植物生長發(fā)育不可缺少的大量營養(yǎng)元素之一。然而土壤有效磷濃度很低，遠(yuǎn)不能滿足植物獲取充足磷營養(yǎng)的需求。玉米是重要的糧食、飼料和能源作物。土壤有效磷不足是限制玉米產(chǎn)量的重要因素。向土壤中大量施加磷肥能減少有效磷不足造成的產(chǎn)量損失，但是磷肥投入不僅大大增加生產(chǎn)成本，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。因此深入研究玉米耐低磷機(jī)制，發(fā)展耐低磷玉米品種，增加玉米在低磷條件下的產(chǎn)量，對農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境都有重要的意義。
　　 轉(zhuǎn)TsVP提高玉米低磷耐受性的研

2、究
　　 通過植物基因工程的手段將有價值的基因轉(zhuǎn)入玉米是發(fā)展耐低磷玉米品種的重要途徑。許多研究表明超表達(dá)氫離子焦磷酸酶(H+-PPase)基因能夠在多種植物中促進(jìn)植物根系生長發(fā)育并能提高植物的抗逆性。在高等植物中，根系是植物吸收礦質(zhì)營養(yǎng)的主要器官，尤其磷素在土壤中的移動性很低，所以根系的生長發(fā)育和形態(tài)結(jié)構(gòu)對捕獲吸收土壤磷素和提高植物耐低磷能力尤為重要。因此為了探索H+-PPase能否提高玉米的耐低磷能力，本工作中我們選用玉米自交

3、系DH4866以及其轉(zhuǎn)鹽芥H+-PPase基因(TsVP)玉米為實(shí)驗(yàn)材料，比較兩者的耐低磷能力以及在低磷條件下的產(chǎn)量，以期得到耐低磷能力提高的轉(zhuǎn)基因玉米材料，為培養(yǎng)耐低磷玉米品種提供育種材料。
　　 將玉米在足磷(sufficientphosphate，SP,1，000μMKH2PO4)營養(yǎng)液中培養(yǎng)20天，然后一半植株在足磷營養(yǎng)液中培養(yǎng)，另一半植株在低磷(lowphosphate，LP,5μMKH2PO4)營養(yǎng)液中培養(yǎng)，共同培養(yǎng)

4、25天。低磷條件下，轉(zhuǎn)基因玉米生長發(fā)育受抑制的程度低于非轉(zhuǎn)基因植株，其地上部分生物量、根系生物量和植株生物量都顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05)，說明轉(zhuǎn)TsVP玉米有較高的耐低磷能力。無論在正常生長條件下還是低磷脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因玉米的根系都比非轉(zhuǎn)基因植株發(fā)達(dá)，其根系生物量干重、根冠比、側(cè)根數(shù)目、側(cè)根長度、總根長和根系吸收面積都顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05)，說明在玉米中超表達(dá)TsVP能夠顯著促進(jìn)玉米根系生長發(fā)育。轉(zhuǎn)基因玉米的莖

5、葉和根部可溶性總糖含量和可溶性總糖含量根冠比與非轉(zhuǎn)基因植株相比都沒有顯著差異(P＞0.05)，說明碳水化合物的含量和分配不是造成轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米根系差異的原因。無論在足磷條件下還是在低磷條件下，轉(zhuǎn)基因玉米植株生長素總含量與非轉(zhuǎn)基因植株相比無差別，但是根系生長素含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株，而莖葉生長素含量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株，說明在玉米中超表達(dá)TsVP能夠促進(jìn)生長素向根系分配。轉(zhuǎn)基因玉米中幾個生長素運(yùn)輸相關(guān)基因（ZmAUX1、ZmP

6、IN1a和ZmPIN1b）的表達(dá)水平顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05)，說明過表達(dá)TsVP可能影響了玉米植株體內(nèi)生長素運(yùn)輸過程。對轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米都外源施加IAA或NPA后，它們在根系生物量和根系形態(tài)參數(shù)方面的顯著性差異消失。這些結(jié)果都說明轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米之間在根系方面的差異涉及生長素的參與，說明在玉米中超表達(dá)TsVP可能是通過促進(jìn)生長素向根部運(yùn)輸從而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因玉米根系發(fā)達(dá)。
　　 不論在足磷條件下還是低磷條件

7、下，轉(zhuǎn)基因玉米的最大吸收速率Imax值都顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05)，但是Cmm和Km值與非轉(zhuǎn)基因植株相比無顯著差異(P＞0.05)，說明玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)體對磷的親和力不是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米磷吸收速率差異的原因，因此推測轉(zhuǎn)基因玉米有較高的吸收速率與其有較發(fā)達(dá)的根系系統(tǒng)有關(guān)。轉(zhuǎn)基因玉米莖葉和根部的磷濃度和磷含量都顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05)，這與其有較高的磷吸收速率相一致。較高的磷濃度對低磷脅迫下的植株的生長發(fā)育極為有

8、利，這可能是低磷條件下轉(zhuǎn)基因玉米生長發(fā)育受低磷抑制的程度比較低的原因。
　　 轉(zhuǎn)基因玉米培養(yǎng)液的pH值顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05)，表明其根際酸化能力高于非轉(zhuǎn)基因植株。但是其根系有機(jī)酸分泌速率與和非轉(zhuǎn)基因玉米相比無顯著差異(P＞0.05），說明有機(jī)酸分泌速率并不是轉(zhuǎn)基因玉米有較強(qiáng)根際酸化能力的原因。但是無論在足磷條件還是在低磷條件下，轉(zhuǎn)基因玉米的P-ATPase酶活性都顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05)，說明在玉米中超

9、表達(dá)TsVP能夠通過提高P-ATPase酶活性從而提高玉米根際酸化能力。
　　 無論在足磷條件下還是低磷條件下轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因植株相應(yīng)部位的組織內(nèi)酸性磷酸酶活性和外泌酸性磷酸酶的活性均沒有顯著差異(P＞0.05)。說明超表達(dá)TsVP并沒有改變玉米的酸性磷酸酶活性，其并不是轉(zhuǎn)基因玉米耐低磷能力提高的原因。
　　 以上結(jié)果表明在玉米中超表達(dá)鹽芥H+-PPase基因TsVP可能通過促進(jìn)生長素向根中運(yùn)輸來促進(jìn)玉米根系生長發(fā)育

10、而且能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜H+-ATPase來提高玉米根際酸化能力。這些特征都與植物適應(yīng)低磷脅迫相關(guān)，根系發(fā)達(dá)以及根際酸化能力增強(qiáng)都有利于植物在低磷條件下的生長。因此推測較發(fā)達(dá)的根系系統(tǒng)和較高的根際酸化能力是轉(zhuǎn)TsVP玉米耐低磷能力提高的原因。
　　 在低磷土壤中，轉(zhuǎn)基因玉米在不同時期的生長發(fā)育受低磷抑制的程度均低于非轉(zhuǎn)基因玉米，其莖葉生物量、根系生物量、植株生物量和生物量的根冠比在各個生長階段都顯著高于非轉(zhuǎn)基因玉米(P＜0.05)

11、，說明在玉米中超表達(dá)TsVP在各個生長階段都能促進(jìn)玉米根系的生長發(fā)育和提高玉米的耐低磷能力。在低磷土壤中生長的轉(zhuǎn)基因玉米的磷濃度和磷含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因玉米(P＜0.05)，這與其有較發(fā)達(dá)的根系和較高的根際酸化能力相一致，而較高的磷濃度又有利于植物在低磷條件下的生長發(fā)育，這可能是低磷土壤中轉(zhuǎn)基因玉米生長發(fā)育受低磷脅迫抑制的程度低于非轉(zhuǎn)基因玉米的原因。
　　 在低磷土壤中生長的玉米的凈光合值和氣孔導(dǎo)度明顯低于在足磷土壤中生長的玉米

12、，而胞間二氧化碳濃度明顯高于在足磷土壤中生長的玉米，說明低磷脅迫造成的植物光合速率下降主要是由非氣孔因素引起的。在低磷土壤中，轉(zhuǎn)基因玉米的凈光合值和氣孔導(dǎo)度顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05)，而胞間二氧化碳濃度顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株(P＜0.05），說明非轉(zhuǎn)基因玉米光合速率低于轉(zhuǎn)基因玉米主要是由非氣孔因素引起的，可能是參與光合作用的一些酶類受低磷脅迫的嚴(yán)重抑制。轉(zhuǎn)基因玉米的磷濃度和磷含量較高有利于葉肉細(xì)胞內(nèi)參與光合作用的酶類避免受到低磷

13、脅迫的嚴(yán)重?fù)p害，因此有利于維持較高的光合作用速率。低磷脅迫嚴(yán)重影響了玉米雌雄穗的發(fā)育和產(chǎn)量的形成。但是轉(zhuǎn)基因玉米受低磷影響的程度低于非轉(zhuǎn)基因玉米，其單株產(chǎn)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因玉米(P＜0.05)，這可能與其有較高的光合速率有關(guān)。
　　 綜上所述，在玉米中超表達(dá)TsVP可能通過促進(jìn)生長素向根的運(yùn)輸來促進(jìn)根系生長發(fā)育，而且能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜H+-ATPase來提高玉米根際酸化能力，因此有助于提高玉米的耐低磷能力。而且在長期低磷脅迫下轉(zhuǎn)

14、基因玉米單株產(chǎn)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因玉米。本研究表明在玉米中過表達(dá)鹽芥H+-PPase基因TsVP對提高玉米的耐低磷能力并緩解土壤缺磷造成的玉米產(chǎn)量損失有重要作用，為耐低磷玉米育種提供了參考資料和種質(zhì)材料。不同磷水平下耐低磷玉米自交系99038和來源親本Qi319microRNA的差異分析
　　 MicroRNA(miRNA)是真核生物中一類長度約為20-22個核苷酸的在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)的小分子非編碼RNA。不僅在植物的生長

15、發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，而且能夠參與植物應(yīng)對逆境脅迫的響應(yīng)過程。越來越多的研究表明miRNA在植物低磷脅迫響應(yīng)過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。鑒定與玉米耐低磷相關(guān)的miRNA有利于深入理解玉米耐低磷機(jī)制，也能為通過基因工程的手段培育耐低磷玉米品種提供有價值的基因。本工作首次揭示具有不同耐低磷能力的玉米在miRNA表達(dá)水平上的差異。所用的玉米材料為玉米自交系Qi319和其耐低磷突變體99038，99038的耐低磷能力能夠穩(wěn)定遺傳，且保持優(yōu)良的

16、農(nóng)藝性狀，是鑒定玉米耐低磷相關(guān)miRNA和研究玉米耐低磷機(jī)制的優(yōu)異材料。通過小RNA高通量測序技術(shù)分別在足磷條件下和在低磷條件下比較Qi319和99038根系中miRNA的表達(dá)水平，并預(yù)測miRNA候選靶基因，以期鑒定出一些可能導(dǎo)致玉米耐低磷能力差異的miRNA。除了鑒定在不同磷水平下兩種基因型玉米間差異表達(dá)的miRNA，通過比較同一基因型玉米低磷條件下植株與足磷條件下植株的miRNA的表達(dá)水平，以期鑒定在玉米中受低磷脅迫調(diào)控的miRN

17、A。
　　 將玉米培養(yǎng)至一葉一心時，去除胚乳，然后分成兩組培養(yǎng)。一組在足磷(sufficientphosphate，SP,1，000μMKH2PO4)營養(yǎng)液中培養(yǎng)，另一組在低磷(lowphosphate，LP,5μMKH2PO4)營養(yǎng)液中培養(yǎng)，共同培養(yǎng)11天。兩種基因型玉米表現(xiàn)出不同的耐低磷能力，99038生長受低磷抑制的程度低于Qi319，其根系生物量和植株生物量都顯著高于Qi319(P＜0.05)。無論在足磷條件下還是在低磷

18、條件下，99038的根系都比Qi319發(fā)達(dá)，其根系生物量、側(cè)根數(shù)目、側(cè)根長度、軸生根長度、總根長和根冠比都顯著高于Qi319(P＜0.05)。
　　 分別取足磷和低磷水平下培養(yǎng)11天的Qi319和99038的根系，提取小RNA，構(gòu)建四個小RNA文庫(Qi319SP,99038SP,Qi319LP和99038LP)，并進(jìn)行高通量測序。從Qi319SP、99038SP、Qi319LP和99038LP四個小RNA文庫中分別鑒定出193

19、、205、208和212個玉米已知miRNA，它們分別屬于25、25、26和26個miRNA家族，并且分別鑒定到46、59、50和54個新miRNA(novelmiRNA)。這些新miRNA的前體長度在67到331個核苷酸之間，平均為159個核苷酸。成熟的新miRNA的長度在20到23個核苷酸之間，大多數(shù)為21個核苷酸(53％)和22個核苷酸(36％)。前體的最小自由能在-18.4到-128.3kcal/mol之間，平均為-60.59k

20、cal/mol。
　　 對鑒定到的26個已知miRNA家族都預(yù)測到了靶基因。這些靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子基因:SBP轉(zhuǎn)錄因子(miR156)、MYB轉(zhuǎn)錄因子(miR159、miR164和miR319)、生長素響應(yīng)因子ARF轉(zhuǎn)錄因子(miR160)、NAC轉(zhuǎn)錄因子(miR164)、NFYA轉(zhuǎn)錄因子(miR169)、AP2轉(zhuǎn)錄因子(miR172)和GAMYB轉(zhuǎn)錄因子(miR319)。參與營養(yǎng)平衡的靶基因:銨轉(zhuǎn)運(yùn)體(miR162)、ATP硫

21、酸化酶(miRNA395)、磷轉(zhuǎn)運(yùn)體(miR399)、銅/鋅超氧化物歧化酶(miR398)和SPX結(jié)構(gòu)域蛋白(miR827)基因等。參與植物生長發(fā)育的靶基因:HD-ZIP蛋白(miR166)、LAC多酚氧化酶(miR397和miR528)基因等。還包括多種多樣有不同功能的靶基因:磷酸酶(miR393和miR319)、抗壞血酸氧化酶(miR397)和藍(lán)銅蛋白(miR408)基因等。對于鑒定到的86個新miRNA，只對其中56個新miRNA

22、預(yù)測到了靶基因。這些靶基因包括:轉(zhuǎn)錄因子、酶類、結(jié)構(gòu)蛋白類和轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白類基因等等。對30個新miRNA沒有預(yù)測到靶基因，可能是因?yàn)閿?shù)據(jù)庫中玉米mRNA信息還不夠全面。大多數(shù)miRNA都有多個靶基因，說明miRNA通常有多種功能。有許多預(yù)測到的靶基因其編碼蛋白還未得到注釋。
　　 分別在足磷條件下和在低磷條件下比較Qi319和99038根系中miRNA的表達(dá)水平，鑒定在兩種基因型玉米間差異表達(dá)的miRNA。在足磷條件下，來自4個已

23、知miRNA家族(miR160、miR164、miR397和miR528)的16個成員和5個新miRNA(mir_20、mir_129、mir_45、mir_172和mir_206)在Qi319和99038間差異表達(dá)。與在Qi319SP中相比，miR160家族成員和3個新miRNA(mir_20、mir_172和mir_206)在99038SP中上調(diào)表達(dá)，而其它miRNA在99038SP中下調(diào)表達(dá)。在低磷條件下，Qi319和99038間

24、差異表達(dá)的miRNA的數(shù)目多于足磷條件下差異表達(dá)的數(shù)目，來自6個已知miRNA家族(miR1432、miR160、miR169、miR164、miR397和miR528)的19個成員和5個新miRNA(mir_99、mir_100、mir_45、mir_172和mir_206)在Qi319LP和99038LP間差異表達(dá)。與在Qi319LP中相比，miR160家族成員和2個新miRNA(mir_172和mir_206)在99038LP文庫

25、中上調(diào)表達(dá)，而其它miRNA在99038LP文庫中下調(diào)表達(dá)。miRNA在基因型間的差異表達(dá)可能會引起兩種基因型玉米耐低磷能力的差異。
　　 除了鑒定不同供磷水平下兩種基因型玉米間差異表達(dá)的miRNA，通過比較同一基因型玉米在低磷條件下的植株與在足磷條件下的植株的miRNA的表達(dá)水平，鑒定出一些在玉米中受低磷脅迫調(diào)控的miRNA。來自10個已知miRNA家族的成員和6個新miRNA在Qi319和99038中受低磷脅迫調(diào)控。其中大部

26、分玉米低磷響應(yīng)的玉米已知miRNA在低磷脅迫條件下都是下調(diào)表達(dá)的，只有兩個miRNA家族(miR399和miR827)的成員在低磷條件下是上調(diào)表達(dá)的，說明miRNA的下調(diào)表達(dá)在玉米低磷響應(yīng)調(diào)節(jié)途徑中有比較重要的作用。
　　 通過real-timePCR確認(rèn)miRNA表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)real-timePCR分析的結(jié)果與高通量測序結(jié)果相符合，說明測序結(jié)果比較可靠。miRNA表達(dá)模式分析結(jié)果表明，高通量測序結(jié)果顯示的在低磷脅迫11天時在

27、Qi319和99038間差異表達(dá)的一些miRNA在低磷脅迫的多個時間點(diǎn)（1、3、7、11和14天）在基因型間都是差異表達(dá)的(P＜0.01)，而且也引起了某些靶基因在玉米基因型間的差異表達(dá)(P＜0.01)，這些靶基因包括miR160的靶基因生長素響應(yīng)因子基因ARF2、miR164的靶基因MYB轉(zhuǎn)錄因子基因和NAC轉(zhuǎn)錄因子基因NAC5和miR397的靶基因laccase基因LAC4。有研究表明這些基因在玉米根系發(fā)育和MYB轉(zhuǎn)錄因子參與的轉(zhuǎn)錄

28、調(diào)節(jié)中起重要作用。
　　 綜上所述，本工作通過小RNA高通量測序技術(shù)分別在足磷條件下和低磷條件下比較玉米自交系Qi319和其耐低磷突變體99038根系中miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)6個玉米已知miRNA家族和7個新miRNA在兩種基因型玉米間差異表達(dá)。miRNA靶基因預(yù)測以及基因表達(dá)水平分析表明某些基因型間差異表達(dá)的miRNA會引起兩種基因型玉米的根系發(fā)育差異和MYB轉(zhuǎn)錄因子參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)差異，推測這些差異可能是99038耐低磷能