利用cDNA-SRAP技術(shù)分析玉米耐低磷基因的差異表達.pdf

1、玉米是播種面積僅次于小麥和水稻的世界第三大作物。在我國，玉米的播種面積很大，分布也很廣，是我國北方和西南山區(qū)及其它旱谷地區(qū)人民的主要糧食之一。土壤缺磷是限制玉米產(chǎn)量的重要因素之一。利用分子生物學(xué)技術(shù)篩選和培育具有高效吸收和利用磷的玉米品種可以有效解決土壤缺磷的問題。本研究采用cDNA-SRAP技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平上進行磷脅迫下玉米基因差異表達的分析，以期為深入了解玉米的磷脅迫應(yīng)激反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.建立了分析玉米

2、耐低磷基因差異表達的最佳cDNA-SRAP反應(yīng)體系。采用水培方法對玉米自交系品種478進行培養(yǎng)，并進行低磷脅迫處理，以分別處理0、3、5、7天478的葉和根為材料提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（分別命名為L0，L3，L5，L7，R0、R3、R5和R7）。以這八個材料的cDNA為模板，我們得到了最佳的cDNA-SRAP擴增反應(yīng)體系及PCR程序。擴增反應(yīng)體系為:總體積20μl，cDNA模板140ng，dNTP0.25mmol/L，Mg

3、2+濃度為1.8mmol/L，正、反向引物濃度分別為0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U。最佳PCR程序為:94℃5 min，1cycle;94℃30 s,35℃30 s,72℃1 min,5 cycles;94℃30 s,50℃30s,72℃1min,35 cycles;72℃10 min,1 cycle。
　　2.獲得了大量的與玉米磷脅迫有關(guān)的基因差異表達片段。利用cDNA-SRAP技術(shù)，以低磷脅迫處理0、3、5、

4、7天的478的葉和根的cDNA為模板，使用30對SRAP引物，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，選取其中擴增結(jié)果較好的10對引物，篩選并回收差異表達片段共計378條，葉和根的cDNA分別擴增出210條和168條差異表達片段，抑制型、誘導(dǎo)型、上調(diào)表達型、下調(diào)表達型和反饋調(diào)節(jié)型片段分別為83條、240條、4條、11條和40條，分別占差異表達片段總數(shù)的22.0％、63.5％、1.1％、2.9％和10.6％。
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