膜孕激素受體在鲆鰈類繁殖周期中的生理功能研究.pdf

1、本研究以工廠化養(yǎng)殖的半滑舌鰨和牙鲆為研究對象,運(yùn)用組織學(xué)切片、電鏡觀察、同源克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增、熒光實(shí)時(shí)定量、放射免疫測定等方法,對親魚卵巢的周期發(fā)育情況、卵母細(xì)胞的發(fā)育特點(diǎn)、膜孕激素受體和新型膜孕激素受體基因的cDNA全長克隆和時(shí)空表達(dá)特征、性類固醇激素在繁殖周期和全年中的變化規(guī)律等進(jìn)行了研究。初步了解卵巢和卵母細(xì)胞不同發(fā)育階段的結(jié)構(gòu)特征、性類固醇激素生理作用、兩種膜孕激素受體基因的生理功能,為提高鲆鰈類的人工繁殖技術(shù)提供了理

2、論依據(jù)。相關(guān)的研究結(jié)果如下:
　　1.運(yùn)用組織學(xué)方法和透射電鏡觀察方法,對性成熟半滑舌鰨卵巢和采集到的卵母細(xì)胞發(fā)育特征進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)卵巢發(fā)育可分為5個(gè)期,卵母細(xì)胞的生長發(fā)育過程可分為5個(gè)時(shí)相。初步判斷:200-500um卵母細(xì)胞為Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞,500-800um卵母細(xì)胞為Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞,800-1000um卵母細(xì)胞為Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞,1000-1200um卵母細(xì)胞為游離在卵巢腔中的卵母細(xì)胞。在200-300um卵母細(xì)胞的濾泡細(xì)胞外

3、層能看見毛細(xì)血管,并且在濾泡細(xì)胞外包被著一層表面上皮,在胞質(zhì)中分布著大量的線粒體;在300-400um卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了皮質(zhì)液泡、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和溶酶體等細(xì)胞器;在400-500um卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)卵黃顆粒,卵膜附近出現(xiàn)高電子密度的物質(zhì);在500-600卵母細(xì)胞中致密的卵黃顆粒上有透明的平行條紋,并且卵黃顆粒之間有大量的線粒體聚集;在600-700um卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)孔道明顯變短、數(shù)量減少;在700-800 um卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)卵黃顆粒附

4、近有比較發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);在800-900um卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中充滿卵黃顆粒,并且卵黃顆粒有相互融合的現(xiàn)象。
　　2.采用同源克隆和末端快速擴(kuò)增方法,首次從半滑舌鰨卵巢中克隆了膜孕激素受體α(mPRα)的cDNA序列,全長為1319bp;將推斷的氨基酸序列與其它物種 mPRα氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析,發(fā)現(xiàn)存在7個(gè)跨膜區(qū)域。聚類分析和序列相似度分析表明:半滑舌鰨mPRα與漠斑牙鲆、大西洋絨須石首魚以及青鳉等魚類的mPRα聚為一支

5、,親緣關(guān)系較近,相似度較高,分別為94％、93%和90%;而與高等哺乳動物人和牛相似性均為53%,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析了mPRα mRNA在性成熟雌性半滑舌鰨不同組織的表達(dá),結(jié)果表明:mPRα組織表達(dá)具有廣泛性,但表達(dá)量存在差異,在腦、卵巢和垂體等組織中表達(dá)豐富,而在肝臟、肌肉、胃、腸和腎臟等組織中表達(dá)較弱。對繁殖周期中,腦、垂體和卵巢的mPRα表達(dá)水平的變化進(jìn)行分析,結(jié)果顯示: mPRα的周期表達(dá)水平,在

6、腦和垂體組織中,當(dāng)卵巢發(fā)育至Ⅳ期時(shí)表達(dá)量最高;在卵巢組織中,mPRα的周期表達(dá)水平在卵巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)表達(dá)量最高。
　　3.采用同源克隆和末端快速擴(kuò)增方法,首次從半滑舌鰨卵巢中克隆得到新型膜孕激素受體(mPRL)的cDNA序列,全長為2002bp。構(gòu)建了14個(gè)物種的mPR家族成員氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹,包括硬骨魚類和哺乳類,發(fā)現(xiàn)此進(jìn)化樹共分為3大分支,分別為mPRα分支、mPRL分支、mPRβ分支,半滑舌鰨mPRL基因?qū)儆谟补囚~類mP

7、R家族新基因分支。序列相似度分析表明:半滑舌鰨mPRL氨基酸序列與青鳉的同源性為68%,與三刺棘魚同源性為72%。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)分析了 mPRL mRNA在性成熟雌性半滑舌鰨不同組織的表達(dá),結(jié)果表明:mPRL組織表達(dá)具有廣泛性,但表達(dá)量存在差異,在卵巢、心臟、鰓和腦等組織中表達(dá)豐富,而在腎臟、肝臟和頭腎等組織中表達(dá)較弱。對繁殖周期中,腦、垂體和卵巢的mPRL表達(dá)水平的變化進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:mPRL的周期表達(dá)水平,在腦

8、和卵巢組織中,當(dāng)卵巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)表達(dá)量最高;在垂體組織中,雖然mPRL的周期表達(dá)水平在卵巢發(fā)育的不同時(shí)期變化不大,但是當(dāng)卵巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)表達(dá)量顯著高于其他繁殖期(P<0.05)。
　　4.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR技術(shù)分析了性成熟雌性牙鲆的膜孕激素受體(mPRα)基因和新型膜孕激素受體(mPRL)基因的mRNA在不同組織的表達(dá)情況,結(jié)果表明:mPRα和mPRL在牙鲆雌魚的所有組織中都表達(dá),只是各自在不同的組織中的表達(dá)量存在差異

9、。mPRα在牙鲆的腦、垂體、卵巢和鰓等組織中表達(dá)豐富,在頭腎、腎臟、胃和腸等組織中表達(dá)較弱;而mPRL在牙鲆的卵巢、心臟、鰓和腦等組織中表達(dá)豐富,在其他組織中表達(dá)量相對較低。對繁殖周期內(nèi),腦、垂體和卵巢的mPRα基因和mPRL基因的周期表達(dá)水平的變化進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:mPRα在腦、垂體和卵巢中的表達(dá)規(guī)律不相同,在腦和垂體組織中,當(dāng)卵巢發(fā)育至Ⅳ期時(shí) mPRα表達(dá)量最高;而在卵巢組織中,當(dāng)卵巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)mPRα表達(dá)量最高。而mPRL在腦

10、、垂體和卵巢中的表達(dá)規(guī)律相同,都是當(dāng)卵巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)達(dá)到高峰值。研究發(fā)現(xiàn):牙鲆中,mPRα基因和mPRL基因在腦、垂體和卵巢組織中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律與分別半滑舌鰨中mPRα基因和mPRL基因在腦、垂體和卵巢組織中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律相似。
　　5.對達(dá)到性成熟年齡的半滑舌鰨和牙鲆血漿中雌二醇和孕酮在繁殖周期中的含量變化規(guī)律與卵巢成熟和基因表達(dá)水平變化規(guī)律分析,結(jié)果顯示:雌二醇在卵黃生成期含量增加,并在卵母細(xì)胞成熟前達(dá)到最高峰值;而孕酮含量的