譯文--土壤微生物多樣性生態(tài)學(xué)理論，分子技術(shù)的應(yīng)用和轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物的影響

1、<p><b>　　精讀報(bào)告</b></p><p>　　原文：J. M. Lynch. A. Benedetti. H. Insam. M. P. Nuti .K. Smalla . V. Torsvik . P. Nannipieri. Microbial diversity in soil: ecological theories, the contribution of m

2、olecular techniques and the impact of transgenic plants and transgenic microorganisms. Biol Fertil Soils (2004) 40: 363–385</p><p>　　土壤微生物多樣性：生態(tài)學(xué)理論，分子技術(shù)的應(yīng)用和轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物的影響</p><p>　　J.M.Lynch

3、3;A. Benedetti·H. Insam·M.P. Nuti·K.Smalla·V. Torsvik·P. Nannipieri</p><p>　　摘要：本文主要討論了三個(gè)相關(guān)主題：生態(tài)學(xué)理論在土壤研究方面的應(yīng)用，用分子生物學(xué)技術(shù)來衡量微生物多樣性以及轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)土壤遺傳多樣性的影響。為慶祝意大利土壤科學(xué)協(xié)會(huì)成立五十周年而在2001年愛瑞斯舉

4、行的土壤緊急會(huì)議上討論了這些議題。因研究地上生態(tài)系統(tǒng)而建立的生態(tài)學(xué)理論卻忽略了地面以下的系統(tǒng)，盡管后者對(duì)于全球性的營養(yǎng)循環(huán)和地球上現(xiàn)存的生命很重要。土壤微生物多樣性對(duì)于很多土壤功能具有決定性的意義，但是在過去卻很難測定其主要成分。傳統(tǒng)的分析方法很有效，但是隨著分子學(xué)方法的應(yīng)用，現(xiàn)在既可以檢測出可培養(yǎng)又可以檢測出不可培養(yǎng)的微生物物種。盡管取得了一些進(jìn)步，但是土壤微生物多樣性和土壤功能性之間的聯(lián)系仍然是一個(gè)很大的難題。一般關(guān)于遺傳改造的細(xì)菌

5、的研究大部分集中在其在環(huán)境中的留存時(shí)間、在根際的定植能力和生存能力，而不直接涉及微生物多樣性的問題。除了與農(nóng)業(yè)實(shí)踐、季節(jié)、田地位置和年代這些相關(guān)的環(huán)境因素以外，人們開始越來越關(guān)注轉(zhuǎn)基因植物對(duì)微生物群落的影響。轉(zhuǎn)基因植物的DNA隨著老化或者退化的植物體或者花粉進(jìn)入土壤。在過濾器轉(zhuǎn)化、無菌土壤中和植物中，通過在實(shí)驗(yàn)室條件下重建去除抗性基因，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因</p><p>　　關(guān)鍵詞：生物多樣性；DNA；遺傳多樣性；分子

6、學(xué)方法；多聚鏈反應(yīng)</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　生物多樣性是指一系列的動(dòng)植物物種，以及其遺傳物質(zhì)和所屬的生態(tài)系統(tǒng)，它包括生態(tài)系統(tǒng)、物種和基因多樣性。它是時(shí)間（進(jìn)化）和空間（地理分布）作用的結(jié)果。生態(tài)系統(tǒng)多樣性是指棲息地、生物群落和含有各種生物生存和進(jìn)化的生態(tài)系統(tǒng)的數(shù)量和豐度。生態(tài)系統(tǒng)由互相依存的物種群落以及與其相關(guān)的自然環(huán)境所組成，

7、其大小不一。物種多樣性是指一定區(qū)域內(nèi)的物種的數(shù)量和豐度，并且這里的物種是指（事實(shí)上或者潛在的）能夠種內(nèi)交配并繁殖產(chǎn)生形態(tài)相似的后代的一群個(gè)體的集合。相同物種的個(gè)體之間無論相似或者不相似，但是對(duì)于每個(gè)物種而言，所有的個(gè)體都必須具有該物種的獨(dú)特特征。但是，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的定義并不適用于無性繁殖的生物（例如細(xì)菌和病毒）。遺傳多樣性是指一個(gè)物種內(nèi)的基因和基因型的變化。它包括生存于地球上的所有動(dòng)植物和微生物的全部遺傳信息。物種由具有不同遺傳特征的個(gè)體組

8、成。根據(jù)現(xiàn)代進(jìn)化理論，遺傳密碼的變異性和適應(yīng)性使得單個(gè)物種逐步進(jìn)化并且能夠在變化的環(huán)境中生存。</p><p>　　諸多土壤問題例如土壤流失、土壤退化和土壤污染等，居于人類在第三個(gè)一千年中為保護(hù)地球和保證人類生存必須解決的15個(gè)危機(jī)之中。雖然由于城市化發(fā)展、侵蝕、森林采伐和污染的蔓延，每年損失上百萬公頃的土地，但是，這個(gè)問題一直沒有受到應(yīng)有的重視。大量的微生物棲居于土壤中并且具有強(qiáng)大的代謝能力，這使得土壤成為一個(gè)

9、十分神秘的生物學(xué)系統(tǒng)。因此，土壤中微生物特性往往比物理或者化學(xué)性質(zhì)對(duì)人工管理和環(huán)境條件的變化更敏感。土壤微生物群的組成變化對(duì)土壤功能完整性很關(guān)鍵。一篇最近的文獻(xiàn)（Nannipieri等.2003）綜述了土壤微生物群落、其多樣性以及其功能之間的相互關(guān)系。該文討論了像低pH值和污染物等環(huán)境壓力對(duì)土壤微生物多樣性和土壤功能的影響，但是未涉及轉(zhuǎn)基因生物的影響。關(guān)于這個(gè)問題，已經(jīng)引起了一些相關(guān)的科學(xué)討論、公眾關(guān)注和國際相關(guān)機(jī)構(gòu)的參與，也有相關(guān)的國

10、內(nèi)或國際法律法規(guī)的建立。</p><p>　　為慶祝意大利土壤科學(xué)協(xié)會(huì)成立五十周年，2001年我們在意大利的愛瑞斯召開了土壤緊急會(huì)議。本篇綜述即整合了許多此次會(huì)議上演講者的投稿。一篇有關(guān)菌根對(duì)土壤健康和肥力影響的綜述已經(jīng)作為學(xué)術(shù)論文發(fā)表。這些投稿都有一個(gè)共識(shí)，那就是，當(dāng)討論土壤危機(jī)時(shí)，土壤微生物多樣性是其中的一個(gè)關(guān)鍵問題，因?yàn)橥寥牢⑸锝Y(jié)構(gòu)和功能多樣性對(duì)土壤肥力有影響。本文討論了檢測土壤微生物多樣性的許多分子生物

11、學(xué)方法，尤其關(guān)注分子生物學(xué)工具和它們在分析土壤微生物多樣性方面的巨大作用。分子生態(tài)學(xué)正在突飛猛進(jìn)的發(fā)展，分子工具靶標(biāo)功能基因?qū)?huì)彌補(bǔ)多樣性-結(jié)構(gòu)信息和微生物活力之間的空缺，這只是時(shí)間的問題。該文也將討論生態(tài)學(xué)理論在土壤研究中的應(yīng)用，盡管這些理論一般只適用于地上系統(tǒng)，但是由于微生態(tài)概念的發(fā)展這些顯得日益重要。本文討論的其他方面有揭露土壤微生物對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的影響，因?yàn)槿藗冊絹碓疥P(guān)注轉(zhuǎn)基因生物在開放性環(huán)境中的使用，例如農(nóng)業(yè)土壤。在這點(diǎn)上，有關(guān)

12、轉(zhuǎn)基因DNA在土壤中殘留的研究已經(jīng)考慮到與植物相關(guān)的細(xì)菌與轉(zhuǎn)基因DNA之間的轉(zhuǎn)化。</p><p>　　2土壤微生物多樣性和功能多樣性和生態(tài)學(xué)理論的作用</p><p>　　迄今為止，生態(tài)學(xué)理論一直致力于研究地上系統(tǒng)。盡管土壤微生物通過營養(yǎng)循環(huán)、分解作用和能量循環(huán)在生態(tài)系統(tǒng)功能扮演著很重要的角色，土壤體系忽略了當(dāng)代生態(tài)學(xué)理論的發(fā)展。在此，我們討論土壤微生物研究如何促進(jìn)生態(tài)學(xué)理論的發(fā)展，反過

13、來這些理論又將如何促進(jìn)我們更好的了解地下系統(tǒng)。</p><p>　　微生物多樣性通常被認(rèn)為是不同分類的生物個(gè)體的數(shù)量以及它們在分類學(xué)中的分布。本文將此概念擴(kuò)大，在生物變型級(jí)別以下用高流量分析或者整體性的工具來評(píng)估個(gè)體多樣性。這包括在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)水平上通過獲得活體信息成像來研究個(gè)體細(xì)胞。整體性的工具也適用于研究單個(gè)微生物細(xì)胞和群落相對(duì)于環(huán)境的功能多樣性。這個(gè)延伸的觀點(diǎn)似乎更適合于土壤環(huán)境的復(fù)雜性。</p

14、><p>　　Shannon-Weaver指數(shù)（H’）通常以以下形式使用：</p><p>　　H’=-Σ(ni/N)log(ni/N)=-Σpi(logpi)</p><p>　　根據(jù)Odum的觀點(diǎn)，ni是指每個(gè)物種的重要值，N是指總的重要值，ni是指每個(gè)物種的重要性概率（ni/N）。這樣，H’把多樣性的豐富度和平等度成分都考慮在內(nèi)。就群落水平生理學(xué)成像而言，可操作單

15、元物種被可操作單元能力替代，以降低某一化合物。</p><p>　　在景觀水平上來講，人們對(duì)多樣性的定義有不同的看法。Whittaker建議將某一生活環(huán)境的群落的物種多樣性（α-多樣性），比率、物種變化隨生活環(huán)境梯度變化的程度（β-多樣性）和同一系列生活環(huán)境的物種豐度（γ-多樣性）區(qū)分開來。從傳統(tǒng)的生境多樣性來看似乎合理，所以這個(gè)概念也可能用于描述土壤微生物多樣性的概念。然而，土壤生物量被界定為一種三維立體多樣性

16、，包括根圍和絕大部分土壤、大團(tuán)聚體和微小聚體、大孔徑和小孔徑以及不同范圍等之間的可能性差異（圖一）。事實(shí)上，在一塊土壤中，有許多的微生境，例如根際、根圍、碎石、腐殖質(zhì)或大塊土壤。土壤在很大程度上是典型的巨大的分層生境，有不同水平層次的范圍，每一個(gè)范圍都可以視為一個(gè)獨(dú)立的整體?，F(xiàn)在仍然不知道這些微生境多樣性是如何并入土壤整體的多樣性的。</p><p>　　圖1 根據(jù)Whittaker的觀點(diǎn)，生態(tài)系統(tǒng)多樣性必須在不

17、同的水平進(jìn)行觀察：一個(gè)棲息群落的物種多樣性（α-多樣性）；隨棲息地梯度變化物種變化的速率和程度（β-多樣性）；一系列棲息地的物種豐度（γ-多樣性）。另外，在土壤中，多樣性的空間變化跟根圍和大塊土、大塊土壤和顆粒土壤、大孔隙和小孔隙和不同的范圍等有著很重要的關(guān)系</p><p>　　我們都知道有很多因素會(huì)影響多樣性，至少在理論上會(huì)影響。這些因素有食物關(guān)系、生活環(huán)境時(shí)間和空間的差異、干擾和富營養(yǎng)化。其中有消極的作用如

18、壓力，積極的作用如資源多樣性或生物之間的相互影響（圖二）。對(duì)多樣性的積極影響可以增加土壤微生物的穩(wěn)定性、彈力、抵抗力甚至生產(chǎn)力。</p><p>　　圖2 外界因素決定多樣性，反過來影響生態(tài)系統(tǒng)</p><p>　　特性，像穩(wěn)定性、抵抗力、豐富度和生產(chǎn)力</p><p>　　生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相關(guān)理論的出現(xiàn)已經(jīng)有近50年了，并且被認(rèn)為是早期生態(tài)學(xué)理論的核心法

19、則。MacArthur在1995年發(fā)表的一篇關(guān)于動(dòng)物種群波動(dòng)和穩(wěn)定性衡量的文獻(xiàn)中假設(shè)，群落穩(wěn)定性將會(huì)隨著食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)而增加，而不是某一物種的個(gè)體生態(tài)學(xué)特性。其前提是，在一個(gè)具有大量能量途徑的生態(tài)系統(tǒng)中單一物種的數(shù)量變化對(duì)其它物種的影響要比在一個(gè)能量途徑少的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)生相同變化時(shí)的影響要小。MacArthur使用了一個(gè)簡單的食物網(wǎng)模型來說明多樣性對(duì)穩(wěn)定性的影響，并且突然改變一個(gè)群落成員的數(shù)量作為干擾。他對(duì)穩(wěn)定性的定義就是依據(jù)群落抵抗外界

20、某一干擾的能力（圖3）。May挑戰(zhàn)MacArthur的假設(shè)并且說明這種干擾應(yīng)該是絕對(duì)值，在這種情況下兩個(gè)群落對(duì)于干擾的敏感程度是相同的。由于支持競爭性假設(shè)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)仍然存有異議，所以30年后這場爭論依然沒有解決。</p><p>　　圖3 MacArthur(1995，左)的食物網(wǎng)模型，May(1973,右)的。MacArthur假設(shè)當(dāng)一個(gè)低多樣性（L）的群落（這里，兩個(gè)成員）在受到外界干擾，如一個(gè)群落成員減少5

21、0%，這種干擾比對(duì)一個(gè)高多樣性的群落（H,20個(gè)物種）來說影響要大。所以，高多樣性的群落會(huì)更加穩(wěn)定。根據(jù)的May的觀點(diǎn)，干擾應(yīng)該用絕對(duì)值，這樣的話這兩個(gè)群落對(duì)于干擾受到的影響都是相同的。</p><p>　　自從MacArthur的食物網(wǎng)模型出現(xiàn)后，人們提出了許多的生態(tài)學(xué)理論或者模型來解釋多樣性-穩(wěn)定性或者多樣性-生產(chǎn)力之間的關(guān)系。我們將討論其中的資源不均一性假設(shè)和保險(xiǎn)假設(shè)。</p><p&g

22、t;<b>　　資源不均一性假說</b></p><p>　　該假設(shè)說明當(dāng)一個(gè)區(qū)域在資源可利用性方面均一的貧瘠時(shí)，它將很難保持許多物種并且它的生產(chǎn)力也將很低（圖4）。該假設(shè)認(rèn)為，隨著生境的平均質(zhì)量的提高，資源的空間變化性和多樣性也將增加，因此導(dǎo)致生產(chǎn)力和多樣性增加。然而，超過某一點(diǎn)，恰恰相反，資源不均一性和多樣性會(huì)減少。這是因?yàn)樵谶@種條件下具有優(yōu)勢的物種在各處有利的小生境中都會(huì)受到偏愛。&l

23、t;/p><p>　　圖4 資源不均一性假說（Tilman 1982），在地域、區(qū)域和全球規(guī)模的角度。</p><p>　　比如說，Hall等發(fā)現(xiàn)資源不均一性和植物多樣性之間存在一種駝背形的關(guān)系。但是，這種駝背形的關(guān)系僅僅適用于局部的和區(qū)域性的規(guī)模，當(dāng)在全球規(guī)模水平時(shí)，能源-豐富度關(guān)系隨著能源單調(diào)遞增。微生物多樣性和能源之間的關(guān)系尚不清楚，但是，從許多植物的特定微生物群看來，由于微生物的資源不

24、均一性增加所導(dǎo)致的植物多樣性的增加，微生物多樣性也會(huì)隨著增加。</p><p><b>　　保險(xiǎn)假說</b></p><p>　　根據(jù)保險(xiǎn)假說，通過抵抗干擾的緩沖效應(yīng)（減少當(dāng)前生產(chǎn)力變化）和性能增強(qiáng)效應(yīng)（增加當(dāng)前平均生產(chǎn)力），物種豐富度對(duì)生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力產(chǎn)生正面的影響。這種效應(yīng)是由單個(gè)物種對(duì)波動(dòng)的反應(yīng)、反應(yīng)的非同步性程度和反應(yīng)的具體形式所決定。由此推知，特別是在像季節(jié)性

25、的干旱或者溫度周期性變化等這些外部因素變化強(qiáng)烈的氣候區(qū)，多樣性顯得很重要。那些在機(jī)能上冗余的物種隨著時(shí)間的變化也不再有很多。Griffiths等證實(shí)，當(dāng)土壤微生物多樣性很低時(shí)，面對(duì)短時(shí)間的壓力（短時(shí)間40℃）微生物功能性恢復(fù)受到消極的影響。在另一方面，在持久的壓力時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)任何的恢復(fù)；但是對(duì)于持久的壓力微生物多樣性高的土壤比低的抵抗力要好。</p><p>　　生態(tài)系統(tǒng)有兩大特性：結(jié)構(gòu)和功能。植物和動(dòng)物水平的結(jié)構(gòu)

26、比土壤微生物水平的結(jié)構(gòu)要明顯。是不是知道誰在負(fù)責(zé)有機(jī)物的降解很重要呢？或者說能不能充分的確定大量的生化途徑是否在正常進(jìn)行？如果是這樣的話，那么功能多樣性將比結(jié)構(gòu)多樣性更加重要。但是有一種共識(shí)就是恒定的環(huán)境下極少數(shù)的物種對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)功能是必需的，在變化的環(huán)境下大量的物種對(duì)于維持生態(tài)系統(tǒng)過程穩(wěn)定性很有必要。根據(jù)Giller等，如果微生物多樣性改變后，土壤微生物的有用的冗余程度將會(huì)導(dǎo)致對(duì)土壤微生物群落沒有影響。如果大量的物種負(fù)責(zé)簡單的功能，任

27、何物種的消失對(duì)于土壤過程都不會(huì)有任何的影響，因?yàn)槠渌挠袡C(jī)體會(huì)填充這個(gè)功能空隙。當(dāng)然，這對(duì)于特殊的功能是不使用的，例如線蟲能抵抗燕麥全蝕病菌。這種功能只屬于單個(gè)物種（熒光假單胞桿菌）并且取決于單一的功能——產(chǎn)生2，4-DAPG。</p><p><b>　　3土壤功能性</b></p><p>　　許多方法可以用來檢測土壤中的微生物過程或者酶反應(yīng)速率。絕大多數(shù)方法得出

28、的是可能的活力，而不是真實(shí)的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)是在充足的底物濃度、最優(yōu)的pH值、溫度值和通常在土壤泥漿里的條件下進(jìn)行。而原來pH值和底物濃度并不是最優(yōu)的，并且溫度和濕度在浮動(dòng)變化。用14C標(biāo)記的化合物監(jiān)測C氧化為CO2或者用15N富集的化合物監(jiān)測土壤中15N的分布，具有代表性的這兩個(gè)例子可以提供土壤生物過程的數(shù)量分析。Nannipieri等討論了例如土壤呼吸、酶活力、硝化作用等傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)和不足。</p><p>　　

29、在土壤生態(tài)學(xué)中變得日益重要的一個(gè)有效方法就是CLPP（群落水平生理學(xué)模型）。這種方法采用了包含95種C源的微平板。一個(gè)微生物群落對(duì)它的利用方式可以潛在的提供這個(gè)群落的功能信息，也可以獲得多樣性參數(shù)，例如H’或者分解代謝的多功能性。但是，這種方法有許多的缺點(diǎn)，它是培養(yǎng)基依賴性的，并且隨著培養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)的組成會(huì)發(fā)生變化。此外，用這種方法不能檢測出真菌對(duì)土壤功能的作用。Degens和Harris在測量土壤微生物群落對(duì)這些化合物的利用方式時(shí)

30、使用了土壤短期反應(yīng)方法，并且加入了氨基酸、羧酸、碳水化合物和有機(jī)物（底物誘導(dǎo)呼吸）以克服上述缺陷（圖5）。</p><p>　　圖5 地表植物對(duì)于土壤微生物群的代謝平均度的影響</p><p>　　一個(gè)長期爭論的問題是：多樣性是否與生產(chǎn)力相關(guān)，特別是植物產(chǎn)量。CLPP方法得出的數(shù)據(jù)經(jīng)常被用于表示土壤功能多樣性。Yan等發(fā)現(xiàn)有機(jī)C和功能多樣性之間存在一個(gè)斷棍的關(guān)系，并且他們也重新計(jì)算了Sha

31、rma等給出的數(shù)據(jù)，該作者曾經(jīng)說發(fā)現(xiàn)了H’和微生物生物量之間存在線性關(guān)系。在那種情況下，斷棍模型給出了最好的解釋（圖6）。</p><p>　　圖6 到了某個(gè)頂點(diǎn)，功能多樣性（H’）隨著土壤中微生物量和/或有機(jī)C的增加而</p><p>　　單調(diào)遞增。數(shù)據(jù)來自Yan等（2000，圓圈）和Sharma等（1997，黑點(diǎn)）</p><p>　　從這些數(shù)據(jù)可以看出，在某一

32、特定的臨界值以前（例如1.7%有機(jī)C），功能多樣性隨土壤微生物生物量單調(diào)遞增。</p><p>　　4檢測微生物多樣性的分子生物學(xué)方法</p><p>　　土壤微生物多樣性通常都是由像可行的培養(yǎng)方法、CLPP和流式細(xì)胞儀等這些方法來分析。這些方法有很多的不足。一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)就是當(dāng)在顯微鏡下觀察土壤細(xì)菌時(shí)，看到的大部分是活的，但是在瓊脂平板上卻不能形成可見的菌落。但是，取自環(huán)境中的樣品無論

33、是可培養(yǎng)的還是不可培養(yǎng)的微生物都可以用基于提取、純化和核苷酸特性的分子技術(shù)來鑒定。這些技術(shù)提供了一種更加精確的土壤微生物多樣性程度衡量方法。這些微生物核苷酸信息可以用來觀察和比較不同系統(tǒng)水平的多樣性，從物種變化到群落多樣性都可以。這一部分綜述了現(xiàn)在研究土壤微生物群落的一些分子學(xué)方法的潛力和缺陷。為了說明分子方法的有效性和簡便性，文章中給出了它們在研究本地有關(guān)受污染和干擾的土壤微生物群落的一些具體應(yīng)用的例子（圖7）。</p>

34、<p>　　圖7 縱覽分析微生物群落的非培養(yǎng)的分子生物方法。PCR聚合鏈反應(yīng)，DGGE變性梯度凝膠電泳，SSCP</p><p>　　單鏈構(gòu)象多態(tài)性，T-RFLP末端限制性片段電泳，RISA基因間隔區(qū)分析，%G+C摩爾%鳥嘌呤+胞嘧啶</p><p>　　從微生物群落獲得的總基因組DNA（元基因組）可以提供全部群落結(jié)構(gòu)和總遺傳多樣性的補(bǔ)充信息。例如，細(xì)菌人工染色體載體可以用來直

35、接從土壤微生物群落中克隆大片段的DNA。通過高和低的分辨率，細(xì)菌人工染色體文庫可以用來在系統(tǒng)發(fā)生和功能水平上研究土壤微生物多樣性。</p><p>　　中等分辨率的方法包括系統(tǒng)發(fā)育探針的應(yīng)用，或者是群落DNA或者RNA的空位或者點(diǎn)墨法雜交，或者是完整的細(xì)胞熒光原位雜交。這些方法可以用來確定目標(biāo)微生物的數(shù)量和測定微生物群落的全部的分類學(xué)組成。</p><p>　　其他的中等分辨率的方法是基于

36、保守基因的序列差異，例如編碼的核糖體RNA、所謂的rDNA。這些指紋識(shí)別方法相同的地方是都使用了PCR來特異擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸。擴(kuò)增的結(jié)果或者用來限制性分析或者基于變性或構(gòu)象性質(zhì)進(jìn)行分離。rRNA或者rDNA的限制性分析[擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）；末端限制性片段電泳（T-RFLP）]可以在高水平的分類學(xué)等級(jí)進(jìn)行區(qū)分，甚至可以鑒別到種。Osborn等曾發(fā)現(xiàn)rRNA的基因的T-RFLP的峰可以用來區(qū)分鞘氨醇單胞菌屬的物種。他們認(rèn)

37、為，從整個(gè)群落和（或）分離的或克隆得到的峰通過與預(yù)先存儲(chǔ)的T-RF片段的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，可以直接鑒定峰中的某些片段在分類學(xué)中的位置。T-RFLP和群落指紋印跡技術(shù)[變性/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）；單鏈結(jié)構(gòu)多態(tài)性（SSCP）]，這些基于分離PCR擴(kuò)增的rRNA和rDNA分子的技術(shù)已經(jīng)被成功的用來分析微生物群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。</p><p>　　高等分辨率的方法包括非編碼DNA區(qū)域的指紋識(shí)別（例如re

38、p-PCR-擴(kuò)增重復(fù)性序列）和編碼區(qū)及非編碼區(qū)的測序。這些方法適合于在種和亞種的水平上區(qū)別和鑒定微生物菌株。高分辨率的指紋識(shí)別方法也已經(jīng)被用于監(jiān)測微生物群落的特殊種群和評(píng)估細(xì)菌群體和克隆基因的多樣性。</p><p>　　5用總基因組DNA方法來分析生物多樣性</p><p>　　土壤微生物群落的組成情況可以通過檢測群落DNA的堿基差異[摩爾%鳥嘌呤+胞嘧啶（%G+C）]來獲得。這個(gè)由熱變

39、性即可測定，因?yàn)閱捂淒NA比雙鏈DNA在260nm的吸光能力大概高35%。用一個(gè)恒溫的試管在慢慢加熱的條件下,通過紫外分光光度計(jì)測定260nm處的吸光度來檢測DNA的解鏈。解鏈曲線轉(zhuǎn)化成%G+C的峰，以此來提供微生物群落的峰，從而能夠指示整個(gè)的遺傳多樣性。即使這種方法被認(rèn)為分辨率很低，但是它可以用來指示整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)的整個(gè)變化，尤其是多樣性很低的情況。DNA堿基組成曲線圖也可以通過笨亞甲胺-DNA復(fù)合物在氯化銫梯度下等密度梯度離心來

40、獲得。雙苯酰亞胺優(yōu)先與A-T堿基對(duì)結(jié)合，這會(huì)使DNA的浮力密度降低。因此，根據(jù)堿基組成通過雙苯酰亞胺密度梯度離心可以將群落DNA分離開來。這種方法有一個(gè)缺陷,就是兩個(gè)具有相似堿基差異的群落不一定有相似的物種組成，這是因?yàn)椴煌奈锓N經(jīng)常有相似的堿基組成。從另外一方面來說，如果群落之間有不同的堿基差異，這可以有力的說明它們之間物種組成是不同的。因此，這個(gè)方法可以用來大致的反應(yīng)干擾條件下微生物群落組成的變化。雙苯酰亞胺-氯化銫梯度超離心分離得

41、到的群落D</p><p>　　從微生物群落分離出來的DNA復(fù)雜性是對(duì)總遺傳多樣性的一個(gè)估計(jì)。當(dāng)在低于其解鏈點(diǎn)溫度大概25℃時(shí)單鏈DNA再退火，變性的比率就指示這個(gè)遺傳復(fù)雜性。隨著DNA復(fù)雜性的提高或者溶液中不同DNA型的數(shù)量，變性比率會(huì)下降。重聯(lián)的DNA部分可以通過C0t值來反映，其中C0是指摩爾核苷酸每升，t是指以秒計(jì)算的時(shí)間。C0t1/2（50%DNA重聯(lián)時(shí)）用來估計(jì)DNA的復(fù)雜性。圖8給出了一個(gè)適于耕種

42、土壤中微生境群落DNA的C0t曲線的例子。土壤微生境或者是埋于甲烷氣體環(huán)境下以此為C源（CH），或者是在厭氧條件下（N2）。用未處理的天然土壤作為對(duì)照。由于復(fù)雜性已知[4.1×106堿基對(duì)（bp）]，E.coli B基因組DNA的重聯(lián)速率作為標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）。為了估計(jì)土壤群落DNA的大小，使群落DNA的C0t1/2除以E.coli B基因組DNA的C0t1/2，然后再乘以E.coli B基因組的大小。</p>&

43、lt;p>　　重連結(jié)果顯示干擾減少了微生物多樣性（圖8，表2）。未受干擾的土壤DNA其C0t1/2值是6300摩爾每秒每升，相當(dāng)于大約8000個(gè)不同的大腸桿菌基因組。氮?dú)夂图淄橛绊懙耐寥繢NA的C0t1/2值分別減少到了2500摩爾每秒每升和300摩爾每秒每升。這分別相當(dāng)于3200和340個(gè)不同的大腸桿菌基因組。</p><p>　　當(dāng)應(yīng)用于微生物群落DNA時(shí)，C0t1/2值被用作遺傳多樣性的一個(gè)參數(shù)，它包

44、含了群落總的遺傳信息（豐富度成分）和不同遺傳型之間的差異信息（均勻度成分）。這使得兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)的群落可能具有一致的C0t1/2值。</p><p>　　圖8 大腸桿菌的DNA的重新組合（C0t，其中C0代表摩爾核苷酸每升，t代表時(shí)間/秒），或未處理土壤中的細(xì)菌部分（K），厭氧條件下的土壤（N2）和CH4作為主要碳源的土壤（CH）（Øvreås等，1998）</p><p&g

45、t;　　表1 土壤微生物多樣性研究的分子學(xué)方法</p><p>　　注：G+C鳥嘌呤+胞嘧啶，PCR聚合鏈反應(yīng)，DGGE變性梯度凝膠電泳，TGGE溫度梯度凝膠電泳，SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性，T-RFLP末端限制性片段電泳，ARDRA擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析，RISA基因間隔區(qū)分析，F(xiàn)ISH熒光原位雜交</p><p>　　表2 在6倍檸檬酸鹽、30%二甲亞砜中計(jì)算得出的微生物群落遺傳多樣性

46、重新組合動(dòng)力學(xué)</p><p>　　注：土壤群落DNA大小用堿基對(duì)（bp），相等的大腸桿菌基因組（E.coli基因組大?。?.1×106bp）（(Brønstad等. 1996; Drønen等. 1998）。C0代表摩爾核苷酸每升，t代表時(shí)間/秒</p><p>　　為了估計(jì)原核生物的多樣性，DNA必須高度純化并且與真核生物的DNA區(qū)分開來。因此，必須使用一

47、種間接地DNA提取方法將土壤中的細(xì)菌分離開，即在細(xì)胞溶解之前進(jìn)行分級(jí)離心。另外，為了更加精確地估計(jì)高純度的DNA，必須使用統(tǒng)一的片段長度。從土壤微生物群落中提取的DNA通常很復(fù)雜，重聯(lián)率也很低，但是如果在檸檬酸鹽溶液和30%DMSO中測量時(shí)它將會(huì)提高。然而，為了更好的估計(jì)C0t1/2值需要重復(fù)多次以達(dá)到50%的重聯(lián)率。</p><p>　　大片段的土壤群落DNA（100kb）不用PCR擴(kuò)增就可以直接克隆進(jìn)BAC載

48、體。從F-質(zhì)粒獲得的BAC載體可以在大腸桿菌宿主內(nèi)穩(wěn)定地保存大的插入序列。在理論上，BAC文庫可以容納全部的微生物群落基因組，并且可以用來繪制基因組圖譜、篩選特殊物種、評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育分析和功能多樣性。這可以通過與特殊探針進(jìn)行雜交、遺傳指紋識(shí)別和測序來實(shí)現(xiàn)。這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不要通過PCR擴(kuò)增，因而避免了許多其他指紋識(shí)別和測序技術(shù)中這一步驟的缺陷。每一個(gè)BAC克隆代表一個(gè)元基因組片段，它可能包含具有它們自己啟動(dòng)子的基因和操縱子，從而能夠使

49、它們在大腸桿菌宿主中表達(dá)。所以，土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育和功能之間的關(guān)聯(lián)信息可以通過克隆體的結(jié)合研究來隱藏rRNA，功能性的基因則可以通過克隆和雜交來獲得。</p><p>　　核糖體RNA基因（rDNA）以及它們的轉(zhuǎn)錄片段和rRNA分子是分類鑒定和衡量微生物遺傳多樣性最常用的標(biāo)記物?；趓RNA的方法已經(jīng)顯示了原核微生物中高度發(fā)散的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，它代表了地球上絕大多數(shù)的遺傳多樣性。這種非培養(yǎng)的rRNA方法揭示了新的血

50、統(tǒng)，在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)角度不同于培養(yǎng)方法和特征性的土壤探針。他們表明來自相似棲息環(huán)境不同地理區(qū)域的微生物有相關(guān)性，但是具有相同官能團(tuán)的微生物可能屬于不同的系統(tǒng)發(fā)生組（親緣型），這反映了生態(tài)位的不同。Tiedje等質(zhì)疑微生物是世界性的這個(gè)假說，他們發(fā)現(xiàn)每一相同大陸區(qū)域每一個(gè)取樣點(diǎn)微生物的基因型都是特異性的。</p><p>　　6土壤微生物群落的遺傳指紋圖譜和通過比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫中的序列來鑒定群落成員</p&

51、gt;<p>　　基于PCR擴(kuò)增的遺傳指紋圖譜方法在分離擴(kuò)增物方法有很多不同的方法。像末端限制性片段長度多態(tài)性，這樣的新方法使用熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增物，然后通過在自動(dòng)測序系統(tǒng)中使用激光檢測熒光DNA片段來分離PCR產(chǎn)物?；赑CR的群落指紋圖譜技術(shù)有許多的優(yōu)點(diǎn)，包括：快速，可以平行分析大量的樣品；可靠，高度的可重復(fù)性；提供一個(gè)群落里的種群的性質(zhì)和數(shù)量上的信息；可以通過比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫中的序列來評(píng)價(jià)群落成員之間的系統(tǒng)發(fā)育

52、關(guān)系。但是，基于PCR的技術(shù)也有很多的缺陷，例如：由于優(yōu)先擴(kuò)增某些細(xì)菌的目標(biāo)DNA序列而導(dǎo)致的PCR擴(kuò)增差異；形成嵌合分子；由于許多的操縱子的存在導(dǎo)致從一株細(xì)菌獲得許多不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；復(fù)雜群落的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量太多以至于很難分離和分析。</p><p>　　用DGGE和TGGE的方法PCR-擴(kuò)增rDNA的DNA指紋圖譜可以提供群落組成的信息。在DGGE/TGGE方法中，相同長度但是不同核苷酸序列的DNA片段被分

53、離。這種分離是基于在一個(gè)線性變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中PCR擴(kuò)增的DNA分子具有不同的遷移率。DGGE依靠變性物質(zhì)（尿素和甲酰胺）的濃度梯度，而TGGE卻基于溫度梯度。具有不同序列的DNA分子在熔解時(shí)將會(huì)產(chǎn)生差異。隨著DNA分子在變性凝膠中遷移，它們開始在特定的熔解區(qū)熔解，因此它們開始變成部分單鏈。部分變性的或者全部變性的分子停止在凝膠中遷移，DNA片段由于不同的堿基組成和序列而在凝膠上占據(jù)不同的位置。使用可以與可變區(qū)附近的保守區(qū)退火的引

54、物，對(duì)微生物群落DNA中的rDNA的可變區(qū)（230-500bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。前面的引物與富含G+C的序列（GC夾子，通常達(dá)40bp長度）相共價(jià)連接以阻止雙鏈全部解鏈。這種技術(shù)的一個(gè)不足就是不同生物的16SrDNA能夠在變性凝膠上形成一條特定的條帶。但是，當(dāng)應(yīng)用于不是很復(fù)雜的群落時(shí)，就可以假設(shè)通過DGGE/TGGE獲得的可辨別的條帶代表群落中的大量的優(yōu)勢微生物種群。群落的分類學(xué)組成信息可以通過凝膠印</p><p&

55、gt;　　DGGE/TGGE方法分析從反轉(zhuǎn)錄PCR的rRNA分子獲得的PCR擴(kuò)增物或許可以得出代謝活躍的微生物種群的指紋圖譜。DGGE/TGGE在快速篩選大量樣本以區(qū)分土壤微生物群落時(shí)很有效。它們在調(diào)查微生物群落空間和時(shí)間的差異時(shí)很方便，可以提供優(yōu)勢菌群的變化信息。</p><p>　　SSCP，像DGGE/TGGE一樣，可以檢測從rDNA可變區(qū)獲得的不同PCR擴(kuò)增物的序列變化。在SSCP中，一個(gè)引物是在5’端磷

56、酸化的，并且擴(kuò)增物中磷酸化的鏈被λ核酸外切酶選擇性的酶切。完整的鏈通過在非變性條件下（低溫）優(yōu)化的SSCP聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離。這種優(yōu)化的凝膠限制雙鏈但是允許DNA鏈的分子內(nèi)部折疊。這種方法是基于單鏈DNA的不同分子內(nèi)折疊，其本身取決于DNA序列的變化。因此，DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變了單鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移速率，從而使其被分辨出來。這種方法的可重復(fù)性和辨別能力取決于片段的大小和片段內(nèi)序列變化的位置，通常片段小于400bp效果最理想。

57、SSCP已經(jīng)被用于區(qū)別純培養(yǎng)的土壤微生物和不同植物不可培養(yǎng)的根圍微生物群落的群落指紋圖譜。SSCP方法原則上比DGGE/TGGE方法要容易操作，因?yàn)樗恍枰獛C夾子的引物和梯度凝膠所需要的特殊儀器。除了PCR本身存在的誤差以外，這種方法的一個(gè)不足就是某一單個(gè)細(xì)菌物種可能產(chǎn)生許多條帶，因?yàn)樵S多操縱子的存在或者單鏈PCR擴(kuò)增物有很多個(gè)構(gòu)象。</p><p>　　T-RFLP方法是基于對(duì)末端熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增物進(jìn)行

58、限制性核酸內(nèi)切酶酶切的一種方法。這些PCR擴(kuò)增物通過使用引物連接到rRNA基因可變區(qū)附近的一致性序列而從微生物群落DNA獲得。兩個(gè)引物通常都是使用熒光亞磷酰胺染料標(biāo)記5’末端。然后擴(kuò)增物通過限制性酶切再進(jìn)行凝膠或者毛細(xì)管凝膠電泳分離。熒光標(biāo)記的片段可以在自動(dòng)分析儀里通過熒光檢測器進(jìn)行檢測，因此，這種技術(shù)只檢測末端標(biāo)記的限制性片段。所以，T-RFLP結(jié)合了PCR、RFLP和凝膠電泳三種技術(shù)。通過使用計(jì)算機(jī)程序在數(shù)據(jù)庫中在16SrDNA序列

59、上確定恰當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，不同的限制性酶切出的rRNA的T-RF片段大小差異可以預(yù)測出來，實(shí)驗(yàn)獲得的PCR擴(kuò)增物的T-RF峰或者從群落DNA獲得的16SrDNA克隆文庫可以與預(yù)測的T-RF峰或者系統(tǒng)發(fā)育分類進(jìn)行比較。這些分析方法已經(jīng)被用來區(qū)分群落和研究土壤中的群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。除了基于持家基因（例如rDNA）的分析，T-RFLP也被用來分析像汞抗性基因這樣的功能基因以及微粒的甲烷單加氧酶基因。</p><p>

60、　　ARDRA是在細(xì)菌鑒定和物種水平分類方面強(qiáng)有力的一個(gè)工具，它已經(jīng)被用來分類大批的分離株和克隆物。在PCR過程中通過加入熒光標(biāo)記的dUTP獲得的熒光PCR擴(kuò)增物可以直接進(jìn)行自動(dòng)的ARDRA。限制性酶切得到的片段通過自動(dòng)DNA測序凝膠分離。然后，酶切樣品數(shù)據(jù)與使用數(shù)據(jù)庫序列獲得的已知細(xì)菌的rDNA限制性分析進(jìn)行比較。</p><p>　　RISA是基于16S和23S rRNA基因之間核糖體基因間隔區(qū)的長度多態(tài)性，

61、這個(gè)間隔區(qū)的長度具有菌株或者物種特異性，通常在50bp到1500bp之間。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離。即使很相近的菌株，核糖體的非編碼間隔區(qū)大小和核苷酸序列都存在變化。這種方法成功地被用來分類菌株和指紋鑒定簡單的群落和混合的種群。RISA的自動(dòng)版本，叫做ARISA，它使用熒光標(biāo)記前端引物來PCR擴(kuò)增內(nèi)部間隔區(qū)。然后片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)大小自動(dòng)分離，它們的大小可以與DNA數(shù)據(jù)庫中的進(jìn)行比較。同時(shí)使用許多引物靶標(biāo)相同樣品中的不

62、同的系統(tǒng)發(fā)生基團(tuán)可以評(píng)估一個(gè)群落中的不同微生物種型的種群動(dòng)力學(xué)。</p><p>　　當(dāng)大量的PCR擴(kuò)增物相似性太高以致于不容易分辨時(shí)，遺傳指紋圖譜方法在區(qū)分高度多樣性的群落時(shí)就有局限。在復(fù)雜的群落中，針對(duì)群落的一部分使用引物靶標(biāo)特殊基因（例如古生菌）或者微生物的功能性基團(tuán)（產(chǎn)甲烷的），可以利用基于rRNA的指紋圖譜技術(shù)來部分的分析群落。根據(jù)Gomes等報(bào)道，區(qū)分不同的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育群體可以使用以下引物：F984G

63、C,F27,R1378和R1494（細(xì)菌）和F243HGC（放線菌），F(xiàn)203α（α-變形菌）和F948β（β-變形菌）。特殊引物也適用于檢測特殊基因，例如類芽孢桿菌，布克氏菌和桿菌。評(píng)估真菌多樣性一直是一個(gè)問題，因?yàn)槭褂玫囊锟梢酝瑫r(shí)擴(kuò)增其他真核生物的DNA，例如植物、水藻和線蟲類的。由Vainio和Hantula發(fā)現(xiàn)的真菌引物已經(jīng)被成功的用于研究熱帶玉米的田間和根圍土壤的真菌群落多樣性。</p><p>　　

64、另外一個(gè)鑒定群落成員的方法就是應(yīng)用特別的富集培養(yǎng)基以加快感興趣的微生物的生長。這種方法在研究功能性群體方面特別有效。</p><p><b>　　雜交技術(shù)</b></p><p>　　該方法是設(shè)計(jì)出與16S rRNA或者23S rRNA序列相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸探針，然后用來和rRNA數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)。探針的特異性取決于目標(biāo)序列的變化。通過選擇rRNA的保守的、

65、可變的和超變區(qū)序列，探針可以標(biāo)記從域到亞種的不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育基團(tuán)。土壤微生物群落主要親緣型的相對(duì)豐度可以用群落DNA數(shù)量點(diǎn)墨雜交或者通過基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行FISH（熒光原位雜交）。在熒光原位雜交方法中，系統(tǒng)發(fā)育探針被用熒光染料標(biāo)記然后用來做環(huán)境樣品的單細(xì)胞的原位檢測（整個(gè)細(xì)胞雜交）。Amann和Wagner等提供了關(guān)于這方面的步驟和方法學(xué)的出色綜述。在probeBase網(wǎng)站可以找到合適的熒光原位雜交的探針（http://w

66、ww.microbial-ecology.net/probebase/）。</p><p>　　雜交方法可以幫助分辨群落中特殊部分（如有機(jī)群體）的物種組成。已經(jīng)證實(shí)，通過使用系統(tǒng)發(fā)育探針，群落指紋圖譜的點(diǎn)跡和Southern印跡雜交在研究群落變化和鑒定大量的優(yōu)勢群落成員時(shí)很有效。點(diǎn)墨雜交和熒光原位雜交已經(jīng)被聯(lián)合用于區(qū)分不同程度的金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)。</p><p>　　在熒光原位雜交技

67、術(shù)中，使用落攝式熒光顯微鏡即可看到被標(biāo)記的微生物。標(biāo)準(zhǔn)的熒光原位雜交方法存在一些缺陷，在敏感度方面它不能檢測出低核糖體含量的細(xì)胞。每個(gè)細(xì)胞的低生理活性往往與低核糖體含量有關(guān)，因此，低生長率或者餓死的細(xì)胞就有可能檢測不出來。為了克服這個(gè)缺陷，人們采用了一種酪胺信號(hào)放大技術(shù)用于FISH，該技術(shù)可以分析緩慢生長的微生物。</p><p>　　FISH已經(jīng)被用于鑒定不可培養(yǎng)的微生物，研究微生物群落的分布和數(shù)量。一系列不同

68、系統(tǒng)發(fā)育探針雜交后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，可以確定體統(tǒng)發(fā)育群體的數(shù)量和分類學(xué)上的個(gè)體的相對(duì)分布。</p><p>　　克隆rRNA基因分析</p><p>　　克隆技術(shù)可以替代指紋圖譜方法來分析PCR擴(kuò)增物，并且已經(jīng)被廣泛的用來分析微生物群落。從環(huán)境中獲得的DNA通過克隆載體由PCR擴(kuò)增rRNA基因得到克隆文庫。細(xì)菌、真菌和古生菌的rRNA基因通過使用區(qū)域特異性和廣泛的引物已經(jīng)被獨(dú)立的PCR反應(yīng)擴(kuò)

69、增出來?？寺〉臄U(kuò)增子可以與指紋圖譜方法的進(jìn)行比較（如ARDRA）。然后通過系統(tǒng)發(fā)育探針點(diǎn)墨印跡雜交鑒定這些克隆。對(duì)這些克隆的rRNA基因進(jìn)行測序，然后與數(shù)據(jù)庫中的進(jìn)行比較可以得出克隆序列之間的聯(lián)系。</p><p>　　7使用分子學(xué)方法在不同水平上評(píng)估農(nóng)業(yè)管理和污染對(duì)于土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響</p><p>　　不同的農(nóng)業(yè)管理和重金屬污染的土壤都使用群落結(jié)構(gòu)的多樣性和變化作為干擾

70、和污染的生態(tài)指標(biāo)。</p><p>　　有上述相關(guān)技術(shù)得出的適于耕種（如谷物、蔬菜和馬鈴薯）的土壤微生物多樣性可以與有機(jī)土壤相比較，在過去的十年中單獨(dú)使用牧場地。這兩種土壤有相似的質(zhì)地（砂壤土），并且坐落于挪威西部400米遠(yuǎn)。重新組合的技術(shù)顯示，根據(jù)C0t1/2值計(jì)算，微生物群落DNA的復(fù)雜性在適于耕種的土壤中大概是1.4×109bp，有機(jī)土壤中大概是3.3×1010bp。這在適于耕種土壤和有

71、機(jī)土里面分別相當(dāng)于大約340和8000個(gè)不同的大腸桿菌基因組大?。?.1×106bp）的遺傳多樣性。由此可見，耕種土壤的總遺傳多樣性大概比相對(duì)沒有受干擾的土壤低24倍，并且整個(gè)的遺傳多樣性提供了一個(gè)很好的由農(nóng)業(yè)管理引起的干擾指標(biāo)。PCR聯(lián)合DGGE顯示，這兩種土壤中的不同細(xì)菌類型的數(shù)量很高，這意味著這兩種土壤多樣性物種豐度很高。由于含有一定數(shù)量的優(yōu)勢菌群和并且許多只是低豐度，耕種土壤的菌群可能要比牧地土壤的分布更加不均勻。這將

72、導(dǎo)致很低的平均度，因此與牧地土壤相比耕種土壤的遺傳多樣性也很低。</p><p>　　由各種技術(shù)得出的無污染的污泥改良的土壤微生物多樣性與（低和高的金屬濃度）金屬污染許多年的污泥處理的田間土壤比較，一方面，這三種處理得出的堿基組成很相似；另一方面，由DNA:DNA重聯(lián)檢測出的總遺傳多樣性是不同的。沒有污染的土壤群落的DNA復(fù)雜度是4.0×1010bp。這相當(dāng)于大約9800個(gè)具有大腸桿菌基因組大小的不同細(xì)

73、菌基因組。金屬污染的土壤多樣性減少，并且與污染的程度有關(guān)。低濃度和高濃度的金屬污染的土壤DNA豐富度分別是1.9×1010bp和6.2×109bp，分別相當(dāng)于大約4600個(gè)和1500個(gè)像大腸桿菌一樣的基因組。</p><p>　　低和高金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)是用基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行雜交得出的，包括α-變形菌（ALF1b）、β-變形菌（GAM42a）、δ-變形菌（SRB385）、嗜纖維素菌

74、-屈撓桿菌-似細(xì)菌（CF319a）、低mole%（G+C）的革蘭氏陽性菌和高mole%（G+C）的革蘭氏陽性菌。這些探針適用于總細(xì)菌群落（FISH），細(xì)菌單體和基于PCR的16S rRNA克隆文庫（空位印跡雜交）。對(duì)大約300個(gè)克隆和300個(gè)細(xì)菌群體一起進(jìn)行分析顯示，非培養(yǎng)方法（FISH和克隆分析）得出相似的結(jié)果，然而培養(yǎng)方法（孤立分析）卻顯示群落組成有很大的不同。低金屬污染的土壤中嗜纖維素菌-屈撓桿菌-似細(xì)菌群體數(shù)量最為豐富。這個(gè)群體

75、在低金屬污染的土壤中的豐富度是高金屬污染土壤的兩倍。在重度金屬污染土壤中，α-變形菌的克隆在數(shù)量上占有優(yōu)勢（圖9）。關(guān)于孤立群，30-37%屬于低mole%G+C的革蘭氏陽性菌。因此，這是兩種土壤中最大的孤立群體。在重度金屬污染的土壤中孤立群的數(shù)量和α-變形菌亞綱的克隆變化明顯，克隆數(shù)比例是38%，孤立群僅只有14%。</p><p>　　這些調(diào)查顯示，在相對(duì)干擾和污染較少的土壤中的總微生物多樣性很高，然而經(jīng)過干

76、擾和污染的土壤中的總微生物多樣性卻劇烈的減少。微生境調(diào)查顯示一些種群類型在壓力條件下會(huì)變?yōu)閮?yōu)勢群體。污染會(huì)導(dǎo)致土壤群落結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的變化。結(jié)果顯示大量的微生物多樣性檢測和群落結(jié)構(gòu)分析方法可以區(qū)別不同程度污染的土壤，可以成為壓力和干擾的有效指標(biāo)。</p><p>　　圖9 低濃度和高濃度金屬污染的污泥土壤群落結(jié)構(gòu)變化。</p><p>　　全部細(xì)胞熒光原位雜交使用了屬特異性的16S和23Sr

77、RNA系統(tǒng)發(fā)育探針，PCR擴(kuò)增的土壤中的總16S和23SrDNA的300個(gè)克隆用點(diǎn)墨雜交。沒有污染的空白對(duì)照土壤也用熒光原位雜交測定。使用與以下系統(tǒng)發(fā)育屬的細(xì)菌相異的探針：α-變形菌（ALF1b）、β-變形菌（GAM42a）、δ-變形菌（SRB385）、嗜纖維素菌-屈撓桿菌-似細(xì)菌（CF319a）、低mole%（G+C）的革蘭氏陽性菌和高mole%（G+C）的革蘭氏陽性菌。對(duì)于縮寫，見圖7</p><p>　　8

78、轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)微生物群落的影響</p><p>　　微生物接種菌在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中已經(jīng)應(yīng)用超過每年3億公頃，其中的一些有歷史安全使用記錄的始于1896年（知名的根瘤菌，用來接種豆科植物）或者19世紀(jì)30年代（例如蘇云金芽孢桿菌，用來生物防治無脊椎害蟲）。其中大多數(shù)的接種菌都由根瘤菌組成，其他的應(yīng)用有接種水稻Azolla-Anabaena、谷類作物或者牧草接種azospirilli（主要有高粱、玉米、小麥）、大量樹木接種

79、菌根真菌（例如柑橘、櫟樹、柳樹、椴樹、榛樹、楊樹、玉米、洋蔥等）和桿菌、假單胞菌和木霉的物種用作生防制劑（例如植物保護(hù)劑抗病原菌，主要是真菌）。其他的微生物制劑有應(yīng)用潛力的現(xiàn)在主要有生物修復(fù)和植物修復(fù)、磷酸鹽增溶、土壤集聚、污物處理、生物浸取、油恢復(fù)、煤炭擦洗和生產(chǎn)生物氣體。至今研究最多的轉(zhuǎn)基因微生物制劑有根瘤菌屬、假單胞菌屬和固氮螺菌屬，這些細(xì)菌已經(jīng)被用來在田間規(guī)模做種子保護(hù)劑以測試其效果，也以此深入的研究其試用的安全相關(guān)的方面，例如

80、它們在土壤環(huán)境中的命運(yùn)。</p><p>　　熒光假單胞桿菌SBW25，分離自甜菜葉面，很容易定植于甜菜的根圍、葉面和小麥的根圍。標(biāo)記基因（lacZY和kanrxylE）被選作標(biāo)記以減少簡單培養(yǎng)方法鑒定和檢測轉(zhuǎn)基因微生物的困難，它定位于6.5Mb染色體的1Mb處以確保遺傳型和表型的穩(wěn)定，并且使與此兩種谷物相關(guān)的微生物種群的任何基因改變變得容易。結(jié)果顯示沒有標(biāo)記基因的運(yùn)動(dòng)，對(duì)于原來的群落只有小的瞬間的影響。隨后，D

81、e Leij等作了研究，使用標(biāo)記基因改造菌株后釋放進(jìn)田間，調(diào)查插入基因?qū)Ω鞣N組成成分生態(tài)競爭力潛在的代謝壓力。但是卡那霉素抗性不影響生物適應(yīng)性，其他的兩種標(biāo)記則減少了生態(tài)競爭力。因此，雖然轉(zhuǎn)基因細(xì)菌在田間具有競爭力，但是野生型的卻具有更強(qiáng)的競爭力。</p><p>　　就功能基因而言，分離自甜菜的熒光假單胞桿菌F113菌株能產(chǎn)生抗生素DAPG。除了能防治腐酶屬引起的枯萎病以外，它也能有效地防治馬鈴薯軟腐病病原菌胡

82、蘿卜軟腐歐文氏菌亞種和馬鈴薯金線蟲。為了作比較，把菌株F113G22進(jìn)行改造以產(chǎn)生Tn5::lacZY 不產(chǎn)生DAPG的衍生的F133，此菌株沒有阻止植物病原菌真菌生長的能力。這個(gè)構(gòu)建的和原來的種群被用來研究熒光假單胞桿菌對(duì)土壤微生物群的影響。其中使用的一個(gè)主要方法是檢測加入構(gòu)建的和原來的細(xì)菌群以后對(duì)根圍、土壤酶N-乙酰氨基葡糖苷酶、果膠酶、酸和堿性磷酸酶、磷酸二酯酶、芳基硫酸酯酶和尿酶，這些酶在土壤的C、N、P和S的循環(huán)中起著重要的作

83、用。在任何土壤變動(dòng)下，轉(zhuǎn)基因標(biāo)記沒有影響任何的土壤酶活性（卡那霉素中加入乳糖）。</p><p>　　然而，關(guān)于接種轉(zhuǎn)基因微生物的影響并沒有直接涉及微生物多樣性的問題，大多數(shù)集中于其他風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的，例如它們在環(huán)境中的抵抗力和根圍的定植能力。當(dāng)將惡臭假單孢菌WCS358r和獨(dú)立的產(chǎn)吩嗪-1-羧酸（抗菌復(fù)合物）轉(zhuǎn)基因微生物WCS358r::phr處理種子后，通過重復(fù)ARDRA產(chǎn)峰集中分析，小麥根部的真菌種群發(fā)生變化

84、。當(dāng)引入的細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較高時(shí)，主要的影響發(fā)生在田間試驗(yàn)的初期；轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)真菌種群的組成比WCS358r的影響時(shí)間要持久。</p><p>　　微生物制劑的國際標(biāo)準(zhǔn)不同的國家都不一樣。為了保護(hù)農(nóng)民和更加容易的控制或者國際機(jī)構(gòu)或相關(guān)當(dāng)局監(jiān)測，有一個(gè)確定一致的國際性的立法將會(huì)很有益的。包括歐盟至今都沒有一個(gè)立法機(jī)構(gòu)。</p><p>　　在過去的二十年中，科學(xué)知識(shí)有了長足的進(jìn)步，可以更加精確

85、地跟蹤環(huán)境中的微生物并且可以在物種和菌株水平進(jìn)行鑒定。這些可以通過一系列的常規(guī)的工具和先進(jìn)的分子技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，這在其他的章節(jié)已有敘述。</p><p>　　9轉(zhuǎn)基因植物對(duì)微生物群落的影響</p><p>　　過去的十年中人們使用了大量的轉(zhuǎn)基因植物，并且許多轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被商品化。但是，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于土壤微生物群落的潛在影響卻鮮有研究報(bào)道。是不是人們覺得轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物種群的影響可以

86、忽略，或者說至少與其他轉(zhuǎn)基因生物安全性問題相比不是很重要，例如抑制雜草物種、對(duì)非靶標(biāo)生物的影響或者新的病毒的出現(xiàn)?；蛘哒f是因?yàn)閷?duì)土壤微生物群的影響難以測定？轉(zhuǎn)基因植物會(huì)出現(xiàn)什么樣的影響？目前，在大規(guī)模使用轉(zhuǎn)基因植物對(duì)根圍和大部分土壤中微生物群落的影響方面，公認(rèn)的有兩種推測：</p><p>　　1.由于根分泌物的改變或者釋放抗真菌、抗細(xì)菌活性或其他的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，接近根部的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能組成什么時(shí)候會(huì)發(fā)生

87、變化？</p><p>　　2.根圍細(xì)菌群落什么時(shí)候能捕獲和穩(wěn)定地整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物的DNA，尤其是轉(zhuǎn)基因植物中作為標(biāo)記的抗性基因。</p><p>　　第一種推測可能影響植物健康或者土壤功能，第二種推測帶來的影響比較間接——標(biāo)記基因的水平轉(zhuǎn)移，主要是看這種水平轉(zhuǎn)移對(duì)于這些基因擴(kuò)散到其他細(xì)菌群落的影響程度。</p><p>　　傳統(tǒng)的育種技術(shù)和遺傳改造一樣，可能會(huì)影響

88、根圍土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，例如根的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的變化、植物分泌物，這些可能影響植物有益微生物和有害微生物的平衡。值得一提的是，如果遺傳改造是為了提高植物對(duì)細(xì)菌或者真菌病原菌的抵抗力而釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，例如細(xì)胞壁溶解酶或者像T4溶解酵素的化合物、幾丁質(zhì)酶或者抗菌肽等，那么就不能排除土壤微生物群落未知的改變，因此應(yīng)該進(jìn)行評(píng)估。但是，評(píng)估轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致的微生物根圍群落潛在的轉(zhuǎn)移十分重要，基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)可以關(guān)聯(lián)自然浮動(dòng)的潛在變化。如前

89、所述，基于核苷酸分析微生物群落可以克服培養(yǎng)方法的缺陷。研究根圍和土壤細(xì)菌群落在時(shí)間上和空間上的變化，必需使用分子生物技術(shù)分析大量的樣本。</p><p>　　最近，人們報(bào)道了很多研究，他們使用了分子指紋圖譜技術(shù)來分析植物生長過程中根圍的動(dòng)力學(xué)和植物物種對(duì)根圍相關(guān)的細(xì)菌群落豐富度的影響，觀察到在植物生長過程中根圍微生物群落的相關(guān)豐度發(fā)生巨大的變化。</p><p>　　轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于根圍微生

90、物群落的結(jié)構(gòu)和功能組成的影響在小規(guī)模水平的田間釋放研究比較理想，因?yàn)檠芯匡@示，溫室觀察與田間條件存在很大的不同。為了檢測轉(zhuǎn)基因的影響，田間試驗(yàn)是在隨機(jī)選擇的大田種植轉(zhuǎn)基因植物，并且在不同的點(diǎn)設(shè)置未遺傳改造的父本作為對(duì)照。因?yàn)檫@些田間試驗(yàn)有足夠的重復(fù)可以分析和可以在不同的田間位置不同的植物生長階段采集樣本，所以這也是研究父本變化和不同的轉(zhuǎn)化之間的有無潛在不同的理想田間試驗(yàn)。通常人們檢測不同的轉(zhuǎn)化水平，由于這樣可以看出基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性的

91、變化。</p><p>　　至今，只有一少部分研究是關(guān)于分析田間條件下轉(zhuǎn)基因植物對(duì)根圍土壤的細(xì)菌群落組成的潛在影響的。在Dunfield和Germida的研究中，他們在加拿大四個(gè)不同的地區(qū)分別種植了四種耐除草劑的和四種常規(guī)的油籽，然后用FAME和Biolog CLPP來分析其兩季的根圍土壤群落特性。轉(zhuǎn)基因耐草甘膦的油籽變種Quest看起來很獨(dú)特，并且其根圍微生物群落與其他的三種耐草銨磷和四種常規(guī)的油籽的根圍微生物

92、群落不同。其他變種的差異似乎主要是由土壤類型的影響。但是，鑒于轉(zhuǎn)基因變種Quest沒有與其未轉(zhuǎn)基因的父本作對(duì)照，所以這種差異是否是由遺傳改造引起尚不清楚。Heuer等研究了田間條件下馬鈴薯根圍細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性，并且與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)T4-熔解酵素的馬鈴薯植株做了比較。與許多其他的轉(zhuǎn)基因植物相比，Düring和Mahn將遺傳改造目標(biāo)改為細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)與植物相關(guān)的細(xì)菌確實(shí)受到了影響，至于易受轉(zhuǎn)基因馬鈴薯影響的胡蘿卜軟腐歐文氏菌明

93、顯的減少了。此外，研究證實(shí)根部檢測到有釋放的T4熔解酵素，導(dǎo)致根表面有殺菌的能力。產(chǎn)T4熔解酵素兩排，一排是沒有T4熔解酵素基因的和另一排父本，在兩個(gè)相距很遠(yuǎn)的田間位置和不同的土壤類</p><p>　　在其他的溫室條件下的研究中報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物和過程的瞬時(shí)的影響。但是，這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)與自然條件變化無關(guān)。轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于土壤微生物群落的影響比在季節(jié)和田間位置等環(huán)境因素下的影響似乎更相關(guān)。（由于環(huán)境影響已經(jīng)

94、排除，所以結(jié)果更能說明轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物群落的影響。）</p><p>　　10土壤中DNA的留存和轉(zhuǎn)基因植物DNA與細(xì)菌之間的橫向轉(zhuǎn)移</p><p>　　自然轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)基因植物基因與細(xì)菌之間發(fā)生橫向轉(zhuǎn)移的最可能機(jī)制。自然轉(zhuǎn)化是指有能力的細(xì)菌可以通過敏感性的DNA酶來獲得自由DNA的過程。細(xì)菌獲得的單鏈DNA或者通過同源重組被整合進(jìn)細(xì)菌的基因組，或者形成一個(gè)自動(dòng)復(fù)制元件。自然轉(zhuǎn)化提供了

95、一個(gè)有能力的細(xì)菌通過獲得其周圍的DNA來產(chǎn)生遺傳多樣性的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明，大于40個(gè)來自不同環(huán)境的細(xì)菌物種是可以發(fā)生自然轉(zhuǎn)化的。Demaneche等最近發(fā)現(xiàn)可以自然轉(zhuǎn)化的細(xì)菌數(shù)量比估計(jì)的要多。自然轉(zhuǎn)化的前提是，可用的自由DNA；競爭性的生長；獲取并穩(wěn)定的整合捕獲的DNA。但是，關(guān)于像在土壤、堆肥、糞便和污物等不同的環(huán)境條件下，細(xì)菌或植物的DNA的自然轉(zhuǎn)化有多重要，至今仍然不清楚。目前，眾多課題組對(duì)于環(huán)境條件下的自然轉(zhuǎn)化主要有兩方面

96、：</p><p>　?。?）自由DNA可以持續(xù)多長時(shí)間，例如在土壤中；這些DNA依然可用于自然變換么？</p><p>　?。?）在環(huán)境條件下不同的細(xì)菌物種有多少能達(dá)到可以自然變換的狀態(tài)？</p><p>　　實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)現(xiàn)了基因的瞬間轉(zhuǎn)移，這提供了理解植物DNA轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中的另外一條可能途徑。</p><p>　　不同的課題組研究顯示，

97、盡管DNA酶普遍存在，但是不同條件下都可以檢測到高分子的自由DNA。有人假設(shè)微生物或者腐敗的植物組織釋放的自由DNA可以作為養(yǎng)料或者自生性細(xì)菌的遺傳信息儲(chǔ)藏庫。不同的有生命的和無生命的因素似乎影響土壤中自由DNA的存留時(shí)間，并且關(guān)于最近出版了關(guān)于非無菌土壤中的DNA存留的一些報(bào)告。微生物活力被認(rèn)為是影響土壤中自由DNA留存的重要生物因素，因?yàn)槲⑸锘盍κ艽碳そ?jīng)常引起DNA酶活力隨著增加。Nielsen等證實(shí)熒光假單胞菌、洋蔥伯克霍德菌和

98、不動(dòng)細(xì)菌屬的細(xì)胞熔解產(chǎn)物是在無菌的和非無菌的土壤中轉(zhuǎn)化DNA的可用原材料，并且細(xì)胞殘骸保護(hù)DNA以防止在土壤中失活，在這過程中細(xì)胞壁或許在細(xì)胞死后起著重要的作用。不同的研究也發(fā)現(xiàn)在微生境和田間條件下轉(zhuǎn)基因植物的DNA有長時(shí)間的留存。在高溫高濕條件下轉(zhuǎn)基因DNA減少得更快。這兩種因素對(duì)土壤微生物活性都具有重要的影響。Gebhard和Smalla等在田間釋放具有轉(zhuǎn)基因抗叢根病的甜菜然后研究其轉(zhuǎn)基因DNA在土壤中的留存。為檢測DNA而不依賴于

99、培養(yǎng)方法，他們直接從土壤中提取總?cè)郝銬NA，然后選用三個(gè)針對(duì)轉(zhuǎn)基因DNA的不同的特殊引物來進(jìn)行擴(kuò)增</p><p>　　隨著植物的衰老和土壤中微生物對(duì)于植物殘?bào)w的降解，轉(zhuǎn)基因DNA也能隨著被降解。但是，實(shí)測到轉(zhuǎn)基因植物DNA卻可以躲過這些降解過程。長時(shí)間的留存會(huì)似乎會(huì)加強(qiáng)細(xì)菌轉(zhuǎn)化的可能性，即使是植物釋放的DNA的一小部分。</p><p>　　在田間種植的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的根圍經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)表達(dá)T

100、4熔解酵素的馬鈴薯的重組DNA。作者指出，兩種DNA似乎可以增加轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)散：成長的根部系統(tǒng)和花粉。與前面的研究相比，De Vries等運(yùn)用一種新的特殊的生物監(jiān)測技術(shù)發(fā)現(xiàn)田間土壤中的轉(zhuǎn)基因植物的DNA最長可以留存達(dá)四年。由于植物DNA可以吸附在土壤顆粒上或者被植物細(xì)胞所保護(hù)，所以這些DNA可以讓植物殘?bào)w附近附著定植的有能力的細(xì)菌所捕獲。直到現(xiàn)在，人們都沒有弄清楚細(xì)菌是否可以被植物DNA所轉(zhuǎn)化。大量的非細(xì)菌DNA和植物DNA的高甲基化

101、速率被認(rèn)為是阻止抗性基因從轉(zhuǎn)基因植物向細(xì)菌轉(zhuǎn)移的因素。許多人之所以沒有檢測到轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)菌之間的水平基因轉(zhuǎn)移，大概是因?yàn)榧?xì)菌中缺少同源序列或者使用了低轉(zhuǎn)化率的細(xì)菌。但是最近人們證實(shí)，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)室條件下，基于同源重組，Acinetobacter sp. BD413 pFG4ΔnptII可以捕獲和整合轉(zhuǎn)基因植物的DNA。還觀察到，不僅轉(zhuǎn)基因植物的DNA而且轉(zhuǎn)基因植物的勻漿都修復(fù)了317-bp的刪除，這將導(dǎo)致具有抗卡那霉素特性的Acine