IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、乳酸對體外培養(yǎng)新生牛脂肪細胞HSL mRNA豐度和酶活性的影響.pdf

1、實驗選取臨床檢查無異常的新生荷斯坦犢牛頸動脈放血致死，無菌開腹切取腹腔內小腸網(wǎng)膜約60g，D-Hank’s液洗滌，分離去除脂肪組織中肉眼可見的纖維成份及血管，按照本實驗室建立的犢牛前脂肪細胞培養(yǎng)方法進行脂肪細胞的原代單層培養(yǎng)，整個培養(yǎng)期為14d。培養(yǎng)至第8、12d，用油紅0工作液和臺盼藍工作液對脂肪細胞分別進行染色，以便觀察其形態(tài)；第14d，選取體外培養(yǎng)單層生長良好的脂肪細胞，在培養(yǎng)介質中分別添加0、10、20、30、40、50μg/L

2、胰島素樣生長因子I(IGF-I)，0、100、250、500、750、1000nmol/L胰高血糖素樣肽I(GLP-I)，0、10、20、30、40、50mg/L乳酸(每濃度梯度設三個重復)，再分別進行培養(yǎng)24tl后提取細胞總RNA，20倍稀釋后用Pharmacia Biotech公司的RNA/DNA calculator測定總RNA的濃度和純度，并用DEPC-H<,2>O將所有樣品的總RNA濃度調節(jié)一致(以消除提取RNA過程中總RNA

3、含量差異，確保定量精確性)。將常規(guī)RT-PCR擴增HSL mRNA模板的純化產物進行質粒的重組、克隆和序列測定。用滅菌純水將以上重組質粒按梯度稀釋后作為熒光定量PCR反應的陽性標準模板，按已建立的PCR反應體系和條件在ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴增儀上擴增，機器自動繪制出標準曲線。將，IGF-I、GLP-I、乳酸處理的脂肪細胞總RNA的反轉錄產物以標準曲線為參照在ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴增儀上擴增

4、，數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件統(tǒng)計分析，觀察IGF-I、GLP-I、乳酸處理的脂肪細胞HSL mRNA豐度的變化。IGF-I、GLP-I、乳酸處理的脂肪細胞在低溫操作室參照南京凱基總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，采用華特生蛋白定量試劑盒測定所提細胞總蛋白濃度，最后用南京建成脂肪酶測定試劑盒測定IGF-I、GLP-I、乳酸處理的脂肪細胞HSL活性變化，數(shù)據(jù)同樣用SPSS40.0軟件統(tǒng)計分析。實驗結果表明：1.IGF-I、GLP-I、乳酸對H

5、SL mRNA表達的抑制作用存在劑量依賴性。[GF-I濃度>20pg/L、GLP-I濃度≥100nmol/L、乳酸濃度>20mg/L時對I-ISL mRNA的表達抑制作用顯著(P<0.05或0.01)。2.IGF-I、GLP-I、乳酸對HSL活性的抑制作用同樣存在劑量依賴性。IGF-I濃度>30pg/L、GLP-I濃度≥100nmol/L、乳酸濃度>40mg/L時對}tSl?；钚缘囊种谱饔妹黠@(P<0.05或0.01)。3.IGF-I、