本科畢業(yè)論文（設(shè)計）--鹽藻sod分子特性研究

1、<p>　　本 科 畢 業(yè) 設(shè) 計 (論 文)</p><p>　　鹽藻SOD分子特性研究</p><p>　　Study molecular properties of SOD from Dunaliella salina</p><p>　　2010年6月 連云港</p><p>　　畢業(yè)設(shè)計（論文）中文摘要</p>

2、;<p>　　畢業(yè)設(shè)計（論文）外文摘要</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　1 緒論………………………………………………………………………………1</p><p>　　1.1 鹽藻的簡介……………………………………………………………………1</p><p>　　1.2

3、 杜氏藻開發(fā)應(yīng)用的現(xiàn)狀和前景……………………………………………2</p><p>　　1.3 超氧化物歧化酶(SOD)的概況……………………………………………3</p><p>　　1.4 植物SOD研究…………………………………………………………………3</p><p>　　1.5 本課題研究的意義……………………………………………………………7</p

4、><p>　　2 材料與方法 ……………………………………………………………………7</p><p>　　2.1 實驗材料………………………………………………………………………7</p><p>　　2.2 實驗方法………………………………………………………………………8</p><p>　　3 結(jié)果與分析…………………………………………

5、……………………………12</p><p>　　3.1 鹽藻SOD的分離純化結(jié)果……………………………………………………12</p><p>　　3.2 鹽藻SOD的純度檢測與分子量測定…………………………………………13</p><p>　　3.3 鹽藻SOD的種類鑒定…………………………………………………………14</p><p>

6、　　結(jié)論 …………………………………………………………………………………17</p><p>　　致謝 …………………………………………………………………………………18</p><p>　　參考文獻……………………………………………………………………………19</p><p>　　附錄 …………………………………………………………………………………22</p

7、><p><b>　　附表清單：</b></p><p>　　表 1 不連續(xù)體系樣品溶解液配制……………………………………………… 10</p><p>　　表2 10%的分離膠系統(tǒng)的組成…………………………………………………10</p><p>　　表3 5%的濃縮膠系統(tǒng)的組成…………………………………………………11&l

8、t;/p><p>　　表 4 鹽藻SOD分離純化結(jié)果……………………………………………………13</p><p>　　表5 加入H2O2后樣液SOD對鄰苯三酚的抑制率……………………………16</p><p>　　圖1 鄰苯三酚自氧化標準曲線………………………………………………… 13</p><p>　　圖 2 樣品SOD電泳圖……………………

9、……………………………………… 14</p><p>　　圖 3 樣品SOD紫外光區(qū)吸收曲線……………………………………………… 15</p><p>　　圖 4 樣品SOD在可見光區(qū)吸收曲線…………………………………………… 15</p><p>　　圖 5 鹽藻樣品SOD全波長掃描………………………………………………… 22</p><p&g

10、t;<b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 鹽藻的簡介</p><p>　　杜氏藻(Dunaliella salina)又稱“鹽藻”,是 1983 年由法國人杜納爾(Dunal)在地中海沿岸鹽池中發(fā)現(xiàn)的。杜氏藻是一類極端耐鹽的單細胞真核綠藻 ,隸屬綠藻門（Chlorophy ta）、團藻目(Volvocales)、多毛藻科(Poly-blepha

11、ridaceae )、杜氏藻屬(Dunaliella ,Teodoresco)[1],是目前世界上最耐鹽的光合生物,主要生活在鹽湖、鹽田以及海洋等高鹽環(huán)境中[2],在微藻產(chǎn)業(yè)中占有重要的地位。</p><p>　　1.1.1 杜氏鹽藻的形態(tài)特征</p><p>　　杜氏藻是單細胞的浮游植物,屬于綠藻門、綠藻綱、團藻目、多毛藻科、杜氏藻屬。其藻體為卵圓形、橢圓形或梨形 ,長18—28um,

12、寬 9.5—14um,運動時體形有變化,在不同的鹽度、光照、溫度等環(huán)境下其形態(tài)變化較大。這是因為杜氏藻沒有纖維質(zhì)的細胞壁,外形隨環(huán)境變化而改變,蛋白核及淀粉粒也隨環(huán)境不同而有變化的緣故[3]。杜氏藻細胞前段一般呈凹陷狀,在凹陷處有兩條等長的鞭毛,鞭毛比細胞長約1/3;藻體內(nèi)有一杯狀色素體,色素體內(nèi)的色素主要是葉綠素和類胡蘿卜素(以β- 胡蘿卜素為主)。在生活條件不良時產(chǎn)生血紅素,藻體呈紅色。在色素體內(nèi)靠近基部有一個較大的蛋白核,細胞上部

13、有一紅色眼點。在不同介質(zhì)和環(huán)境中生長的鹽藻,其色素顏色和細胞內(nèi)含物均有所不同[4]。杜氏藻在生長期間以無性繁殖為主藻體在運動中縱裂為二,各形成一個新體。分裂旺盛時,顯微鏡下?？梢姷?—8個新個體同時形成。分裂期藻體較小,常呈綠色;成熟后個體結(jié)合成合子,合子呈球形,比藻體大,有光滑的薄壁,每一合子進行減數(shù)分裂,最終產(chǎn)生16個游動孢子[5]。</p><p>　　1.1.2 杜氏鹽藻細胞組成</p>

14、<p>　　杜氏藻無細胞壁,細胞灰分含量低于其它綠藻,蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素含量相對較高。在正常生長條件下的綠色細胞中的蛋白質(zhì)含量占細胞干重的 50%—60%,碳水化合物占 12%—40%,脂類占6%—10% [6],杜氏藻蛋白質(zhì)中包括全部氨基酸并以賴氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、氨羥丁氨酸為主。杜氏藻的脂肪含量與硅藻相近,其脂質(zhì)中含有多種脂肪酸,不飽和脂肪酸占有優(yōu)勢[4,7]。</p><

15、;p>　　1.1.3 杜氏鹽藻營養(yǎng)成分</p><p>　　杜氏藻細胞的有機成分與其它綠藻基本相似,但其組成的相對豐度又有自己的特征。杜氏藻體內(nèi)的β- 胡蘿卜素和極性脂類含量很高[8,9] 。杜氏藻中甘油含量也很高,甘油參與滲透壓的調(diào)節(jié),直接與生長環(huán)境中的NaCl濃度呈正相關(guān)。很早就有人提議用杜氏藻來生產(chǎn)甘油,因為藻體內(nèi)積累的甘油濃度最高可達生物量的50%。杜氏藻與嗜鹽細菌相同,體內(nèi)的蛋白質(zhì)中酸性氨基酸含

16、量偏高,色氨酸含量高,但缺乏氨基乙磺酸和脯氨酸。在另一杜氏藻品種（D.bardawil ）中,還發(fā)現(xiàn)了稀有氨基酸,如磷酸絲氨酸和鳥氨酸。</p><p>　　1.2 杜氏藻開發(fā)應(yīng)用的現(xiàn)狀和前景</p><p>　　杜氏藻的開發(fā)應(yīng)用受到人們越來越多的關(guān)注,它不但在食品保健、醫(yī)藥制品等方面得到開發(fā)利用,而且在化妝品、飼料等方面也受到人們的青睞,作為生物技術(shù)或基因工程的受體在科研上也有了一席之

17、地。在石油地質(zhì)研究領(lǐng)域,認為藻類是烴源巖的主要母質(zhì)來源之一,已被越來越深入地研究和應(yīng)用[4,10- 12] 。</p><p>　　1.2.1 營養(yǎng)食品</p><p>　　杜氏藻營養(yǎng)健康食品可分為兩類:一是直接用食品級干藻粉制成藻片或膠囊營養(yǎng)保健食品;二是個別產(chǎn)品獲得醫(yī)藥批文,成為治療藥物。杜氏藻的營養(yǎng)價值較高,原因是其蛋白質(zhì)含量高達 65%—70%;細胞內(nèi)含有多種維生素;富含8 種人

18、體必需的氨基酸;含有多種微量元素,如鐵、鉀、鈉、鎂和鈣等;含有大量的藻膽蛋白 ,能增強機體的免疫功能。杜氏藻中含大量的β- 胡蘿卜素,可有效地抗生物氧化。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織 (WHO )食品添加劑委員會一致推薦并認定β-胡蘿卜素為A類營養(yǎng)色素。從 1993年起,我國批準β-胡蘿卜素作為營養(yǎng)強化劑可添加到嬰幼兒食品和乳制品中。</p><p>　　1.2.2 醫(yī)藥領(lǐng)域</p>&

19、lt;p>　　杜氏藻在脅迫條件下可大量積累β-胡蘿卜素,最高可達干重的14%,為自然界所有生物之首。早在1966年,Massyuk 就提出可以大規(guī)模培養(yǎng)杜氏藻生產(chǎn)β- 胡蘿卜素[13]。由于β- 胡蘿卜素具有抗氧化作用,可提高機體的解毒功能,抑制致癌物質(zhì)的活性,因此可預防腫瘤的發(fā)生。目前我國所需的天然β-胡蘿卜素從國外進口較多,國內(nèi)生產(chǎn)的天然β-胡蘿卜素一般是從天然果蔬中提取的,其效率低,成本高,價格昂貴。杜氏藻中的β-胡蘿卜素含

20、量居藻類之首,是極具開發(fā)潛力的藻種[14] 。</p><p>　　1.2.3 餌料與飼料</p><p>　　杜氏藻富含蛋白質(zhì)、天然胡蘿卜素、碳水化合物、維生素、不飽和脂肪酸、多糖、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)[15]。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)它是一種優(yōu)質(zhì)餌料,可提高水產(chǎn)動物特別是海珍品育苗的成活率,降低育苗成本,提高幼體的免疫力和活力,還可使觀賞魚的體色鮮艷 。</p><p>

21、　　1.2.4 美容與化妝品</p><p>　　杜氏藻富含多種營養(yǎng)物質(zhì),一些醫(yī)療機構(gòu)的臨床試驗表明,其營養(yǎng)液能提供皮膚所需的氨基酸、藻多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等多種營養(yǎng)活性成分,而且由于其營養(yǎng)豐富的緣故,它還有清除自由基的能力,起到防皺、抗輻射、抗衰老的作用。從其細胞中提取能夠吸收紫外線的酪氨酸制劑,可防曬、祛斑。同時,由于其化妝品的透過性好,能對皮膚表面和深層進行營養(yǎng)和互利,對皮膚沒有刺激和致敏作用[

22、16]。</p><p>　　1.2.5 廢水凈化與環(huán)境保護</p><p>　　氯化消毒是城鎮(zhèn)水廠目前廣泛應(yīng)用的方法。氯與水中的微量有機物反應(yīng)生成三氯甲烷、四氯化碳等一系列消毒副產(chǎn)品,長期飲用會產(chǎn)生致突變、致畸變、致癌變的作用。利用鹽藻生長阻礙試驗測定排放到環(huán)境中特別是飲用水中的有機毒物,可在短時間內(nèi)準確得到被測毒物的半有效阻礙濃度( ECso),從而可得知被測化合物的生物毒性,可作為

23、一種飲用水污染測試行之有效的方法,在水質(zhì)污染監(jiān)測和控制方面有著廣闊的應(yīng)用前景[17] 。由于在養(yǎng)殖過程中,杜氏藻能夠吸收有機廢水中的營養(yǎng)源,在廢水處理中很有前途,而且養(yǎng)殖出來的杜氏藻還可用作飼料或肥料,這種廢水凈化方式成本低,耗能少,效益明顯,開發(fā)潛力大。</p><p>　　1.3 超氧化物歧化酶(SOD)的概況</p><p>　　1.3.1 SOD 酶概念</p>

24、<p>　　SOD 酶全稱為超氧化物歧化酶。自從Mann 和Keilin1938 年首次從牛紅血球中分離出一種藍色銅蛋白(最初定名為血銅蛋白Hemocuprein)[18] ,后來由McCord 和Fridovich 根據(jù)其酶活特性定名為超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase 簡稱SOD)。SOD 屬于金屬酶，按照結(jié)合金屬離子種類不同，該酶有以下三種：含銅與鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、含錳超氧化

25、物歧化酶（Mn-SOD）和含鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）[19]。SOD 是生物體防御氧化損傷的一種主要酶。SOD 作用于底物超氧陰離子(O2?-),將其分解成O2和H2O2,H2O2 再經(jīng)過氧化物酶與過氧化氫酶的催化變成H2O,從而解除O2?- (超氧陰離子) 對生物體細胞的損傷,起到保護作用。由于O2?-性質(zhì)活潑,極具破壞作用,因而當機體內(nèi)有過多O2?-積累時可誘發(fā)多種疾病。SOD作為體內(nèi)自由基的有效清除劑,能使自由基的形成和消

26、除處于動態(tài)的平衡,從而抵御O2?-的毒害作用[20]。因此,人們將SOD稱之為生物體內(nèi)重要的O2?- 清除劑。反應(yīng)式如下:</p><p>　　1.3.2 SOD 酶的作用及應(yīng)用</p><p>　　SOD 酶在食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。SOD作為添加劑已用于高級化妝品中,如國內(nèi)大寶SOD、康妮SOD、SOD康舒達霜劑等。SOD作為化妝品有明顯的防曬效果，它能防止皮膚衰老，阻止紫褐質(zhì)(

27、老年斑)的形成，同時也預防和治療皮膚病。在食品方面,SOD可添加到飲料、乳制品、中老年食品、嬰幼兒食品、病人康復食品等各種營養(yǎng)保健食品中，提高人體抵御O2?- 侵害的能力，起到防患于未然的保健功效[21,22]。</p><p>　　1.4 植物SOD研究</p><p>　　氧自由基（Reactive Oxygen species,ROS）或稱活性氧,主要包括超氧陰離子自由基、羥自由,

28、以及有機過氧化物自由基等。生命體在正常代謝過程中產(chǎn)生 ROS, 而一些外界環(huán)境因素能增加細胞中 ROS的濃度,若不能及時清除以恢復平衡,會引起生物膜的過氧化損傷,甚至造成細胞器的損害和DNA與蛋白質(zhì)等的降解與失活。生命有機體在進化過程中形成并發(fā)展了清除活性氧的系統(tǒng),例如抗氧化酶系統(tǒng)和非酶性小分子抗氧化系統(tǒng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase , SOD）是 McCora 等人于1968 年在小牛血液細胞中首次發(fā)現(xiàn)的,

29、它催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為 H2O2和 O2 的反應(yīng)。SOD 廣泛存在于生物體內(nèi),在生命體的自我保護系統(tǒng)中起著極為重要的作用在免疫系統(tǒng)中也有重要的功能?！?lt;/p><p>　　植物由于其生長過程中相對固定不變的位置,在自然界中更易受到強光、干旱、高溫、低溫、輻射等各種外界因子的脅迫。已知這些逆境條件,都能通過 ROS的提高而對植物細胞帶來傷害。又因為農(nóng)作物抗逆性是生產(chǎn)上倍受關(guān)注的問題,因而植物的 SOD 研究亦受到重

30、視。</p><p>　　1.4.1 植物SOD在細胞內(nèi)的分布</p><p>　　SOD 是一種含金屬的抗氧化酶 ,在植物界普遍存在而且具有多種類型。這些不同類型的SOD具有不同的分子質(zhì)量和氨基酸序列,而且位于酶活性中心的金屬原子也不同。根據(jù) SOD 所結(jié)合的金屬原子的不同,植物SOD可分為三種類型:Mn-SOD 、Cu/Zn-SOD 和 Fe-SOD。低等植物以 Fe-SOD 和Mn

31、-SOD為主,高等植物以 Cu/Zn-SOD為主,Cu/Zn-SOD主要位于細胞質(zhì)和葉綠體中,Mn-SOD主要位于線粒體中,Fe-SOD一般位于一些植物的葉綠體中。Fe-SOD和Mn-SOD在序列和結(jié)構(gòu)上具有很高的同源性,Cu/Zn-SOD與Fe-SOD或Mn-SOD之間不存在同源性,SOD存在于植物細胞內(nèi)所有能夠產(chǎn)生活性氧的亞細胞結(jié)構(gòu)中,在不同植物,以及同一細胞的不同亞細胞結(jié)構(gòu)中SOD的類型和酶活性存在差異。</p>&

32、lt;p>　　植物Mn-SOD同酵母和動物體內(nèi)的Mn-SOD一樣都與線粒體密切相關(guān),它由核基因編碼 ,在細胞質(zhì)中合成蛋白質(zhì)前體,蛋白質(zhì)前體在線粒體前導肽作用下運輸?shù)骄€粒體內(nèi)發(fā)揮功能[23]。Cu/Zn-SOD主要位于植物細胞質(zhì)和葉綠體中[24],其中葉綠體Cu/Zn-SOD由核基因編碼,在細胞質(zhì)中合成后由葉綠體前導肽引導進入葉綠體內(nèi),細胞質(zhì)Cu/Zn-SOD主要位于靠近液泡、細胞核、質(zhì)外體的細胞質(zhì)區(qū)[25]。Ogawa等[26]采

33、用免疫組織化學和免疫電子顯微鏡技術(shù),首次發(fā)現(xiàn)在菠菜葉肉細胞的細胞核中存在Cu/Zn-SOD,它具有保護核DNA免受氧化損傷的功能。此外 ,在藻類和某些高等植物如白菜、擬南芥、煙草、水稻、柑橘中發(fā)現(xiàn)了Fe-SOD的存在。除了細胞質(zhì)、葉綠體和線粒體這些亞細胞結(jié)構(gòu)外,SOD還存在于乙醛酸循環(huán)體[26]和過氧化物酶體中 [27]。</p><p>　　1.4.2　植物SOD的理化性質(zhì)</p><p&g

34、t;　　動物、植物和真菌中的Cu/Zn-SOD是分子質(zhì)量約32kDa的同源二聚體酶,其中一個亞基結(jié)合一個Cu原子,另一個亞基結(jié)合一個Zn原子,兩個亞基間的相互作用提高了酶的催化活性和穩(wěn)定性,金屬原子的氧化還原完成了酶的催化功能。來自不同植物的細胞質(zhì)Cu/Zn-SOD彼此之間在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上具有很高的同源性,不同的葉綠體Cu/Zn-SOD彼此之間也具有很高的同源性,而細胞質(zhì) Cu/Zn-SOD 和葉綠體 Cu/Zn-SOD 由于在不同

35、亞細胞結(jié)構(gòu)中發(fā)揮功能,雖然它們在進化上起源相同,但仍存在一定差cDNA和氨基酸序列分析表明 Cu/Zn-SOD 蛋白質(zhì)分子上與金屬原子相結(jié)合的位點十分保守:Cu原子與48、50、77 和135處的組氨酸相結(jié)合;Zn原子與77、86、95處的組氨酸和98處的天冬氨酸相結(jié)合。大多數(shù)原核生物的Fe-SOD和Mn-SOD是同源二聚體,而植物等真核生物的Fe-SOD和Mn-SO是同源四聚體 ,組成 Fe-SOD和 Mn-SOD 的每個亞基的分子質(zhì)

36、量約為20 kDa ,而且每個亞基結(jié)合有一個Fe/Mn原。Fe-SOD 和 Mn-SOD具有同源性,它們與金屬相結(jié)合的活性中心的</p><p>　　1.4.3　超氧化物歧化酶與植物抗逆性關(guān)系</p><p>　　(1) SOD與溫度脅迫</p><p>　　植物寒害是世界比較嚴重的自然災害之一,當環(huán)境溫度降到一定程度時,植物體就會受到傷害。低溫逆境不可逆?zhèn)Φ脑?/p>

37、初反應(yīng)發(fā)生在生物膜系統(tǒng)的類脂分子的熱致象變上,因此植物對低溫逆境的適應(yīng)也就在于減輕或避免膜脂象變的發(fā)生。低溫對植物的傷害按低溫的程度和植物對低溫的反應(yīng)類型可以分為兩種,即凍害(freezing injury),指零下低溫使植物產(chǎn)生冰凍傷害和冷害(chilling injury),未能引起組織、細胞結(jié)冰的零上低溫對植物生理功能的傷害。對植物進行低溫處理后,SOD 的活性也會隨之發(fā)生變化,研究者普遍認為 SOD 的活性與植物抗寒能力的強弱有

38、很大關(guān)系。用不同的材料在不同時期進行冷處理表明,植物體內(nèi)SOD活性普遍升高,而且抗性越強升高越多;例如水稻和黃瓜在白天15℃、晚上10℃的條件下處理3d,SOD活性、濃度和穩(wěn)定性均升高。也有少數(shù)報道說在冷處理后 ,抗寒性不同的品種,其SOD活性表現(xiàn)不同;例如番茄在苗期和花期用8℃的低溫處理,抗寒力強的品種活性升高,而抗寒力弱的品種沒有顯著變化。一般當植物處于45℃左右的溫度時,就會受到傷害或引起死亡。高溫對植物的傷害主要是損害細胞膜系統(tǒng)

39、和蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)</p><p>　　(2)　SOD與水分脅迫</p><p>　　在植物體內(nèi),水幾乎參與所有的代謝過程。當環(huán)境中可利用的水分低到不足以維持植物的正常生命活動需要時,植物的生長發(fā)育就會受到傷害。干旱對植物的影響非常廣泛而深刻,其影響主要表現(xiàn)在生長各階段,如萌發(fā)、營養(yǎng)生長、生殖生長,以及一些代謝過程如光合作用、呼吸作用、水分和養(yǎng)分運輸?shù)确矫?所以植物的抗旱性非常重要。研究結(jié)果顯

40、示,SOD 對植物抗旱起著關(guān)鍵性作用。在研究中發(fā)現(xiàn),隨植物種類的不同,SOD活性也有升有降如槭樹在干旱脅迫下SOD活性先下降而后逐漸回升至接近正常的水平;嫩莖花椰菜SOD活性在嚴重干旱脅迫下先下降后升高,而在輕度干旱脅迫下急劇升高,這說明適度干旱脅迫對植物具有抗旱鍛煉的效果,但過度或過快的干旱處理則會使植物SOD失活。但是從總體而言,當SOD活性升高時抗旱品種比對干旱敏感的品種升高幅度更大;而當SOD 活性下降時,抗性品種比對干旱敏感的

41、品種下降幅度更小。水分不足固然會對植物造成損傷,而水分過多對植物生長發(fā)育同樣是不利的。在水分過多的情況下,植物氧虧缺導致呼吸從有氧型變?yōu)闊o氧型,ATP產(chǎn)率下降,無氧呼吸形成有毒的末端產(chǎn)物,從而導致植物傷害。目前國內(nèi)外對SOD與植物抗?jié)承躁P(guān)系的研究還不</p><p>　　(3) SOD與高鹽脅迫</p><p>　　自然條件下,生長在干旱、半干旱地區(qū)的植物由于蒸發(fā)和植物蒸騰,帶走了土壤

42、中的水分,留下大量的鹽分在土壤中,因此常受鹽害而不能存活。過多的鹽分主要從兩個方面影響植物的生長:土壤滲透勢的降低對植物造成水分脅迫,或者土壤中某種離子濃度過高形成離子不平衡而產(chǎn)生毒害。大多數(shù)植物沒有鹽生植物那樣的抗鹽結(jié)構(gòu),只能依靠其自身的代謝調(diào)節(jié)機制抵抗鹽害。通過對水稻 、狹葉羽扇豆、煙草[31] 等的研究結(jié)果看,在鹽害環(huán)境SOD活性都是升高的,只是 Cu/Zn-SOD活性升高而其它SOD活性沒有太大變化。只有在 NaCl 脅迫下,轉(zhuǎn)

43、基因SOD植物中Cu/Zn-SOD活性不變而Fe- SOD和Mn-SOD活性下降,而作為對照的幾種非轉(zhuǎn)基因植物的三種SOD活性都是下降的。</p><p>　　(4)　SOD與化學藥劑及有毒氣體脅迫</p><p>　　作為人為的不良環(huán)境,近幾十年來已經(jīng)成為植物生長發(fā)育的巨大威脅,嚴重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。在化學藥劑 如百草枯和有毒氣體如O，SO等作用下,一般說來植物的SOD活性都是升

44、高的,這與上述逆境所導致的氧化脅迫增加相適應(yīng),如萵苣葉片暴露在O中后SOD活性明顯升高[32]。但是也有報道說煙草和西紅柿中SOD沒有表現(xiàn)出對百草枯的抗性。</p><p>　　(5) SOD與病害脅迫</p><p>　　植物在其一生的生命活動中,除了會遇到一些物理、化學因子影響外,還會受到一些生物因素的危害,導致生病,從而影響正常的生長發(fā)育過程,嚴重時甚至死亡。國內(nèi)用 SOD 防治煙

45、草氣候斑點病[33]的效果極為顯著;煙草接種馬鈴薯Y病毒 PVY后2～4d內(nèi)SOD 活性沒有明顯變化,隨后才顯著升高,至第8 d達高峰值,而14 d后開始降低。國外對小麥斑點病、黃瓜霜霉病、棉花黃萎病等也進行了研究,結(jié)果顯示凡感染病害的植株其體內(nèi)SOD活性都有所增強。此外,輻射脅迫對植物的影響也很大。在對SOD與植物抗輻射關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),SOD活性在中午強光照射下最高,SOD活性隨小麥受光氧化脅迫的時間增加而減少。</p>

46、<p>　　1.5 本課題研究的意義</p><p>　　鹽藻富含豐富的多種營養(yǎng)成分，其經(jīng)濟效益不言而喻。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體防御氧化損傷的一種主要酶。在臨床治療和預防、食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，工業(yè)上對其需求也越來越多。同時對植物SOD的研究將成為今后研究的重點。但對鹽藻中SOD方面的研究未見報道過。本文對從鹽藻中提取和純化的SOD進行分子特性的研究，以便為鹽藻的SOD分子特性方面

47、的研究提供基礎(chǔ)資料。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p><b>　　2.1.1 鹽藻</b></p><p>　　由中國海洋大學提供的杜氏鹽藻（Dunaliella salina），實

48、驗前經(jīng)過擴繁并培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。</p><p><b>　　2.1.2 試劑</b></p><p>　　氯化鉀 KCl 分子量74.55 南京化學試劑廠</p><p>　　氯化鈣 CaCl2 分子量110.99 天津市塘沽濱?；S</

49、p><p>　　氯化鈉 NaCl2 分子量58.44 南京化學試劑有限公司</p><p>　　氯化錳 MnCl2·4H2O 分子量197.91 天津市化學試劑三廠</p><p>　　硫酸鎂 MgSO4 分子量120.37 天津市大茂化學試劑廠</

50、p><p>　　硫酸銅 CuSO4 分子量159.60 上海化學設(shè)備采購供應(yīng)站 </p><p>　　硫酸鐵 FeSO4·7H2O 分子量278.01 江蘇徐州試劑二廠</p><p>　　硫酸鋅 ZnSO4·7H2O 分子量287.56 天津市天大化工實驗

51、廠</p><p>　　硝酸鈉 NaNO3 分子量84.99 合肥工業(yè)大學化學試劑廠</p><p>　　硼酸 H3BO3 分子量61.83 北京朝陽區(qū)金盞化工廠</p><p>　　磷酸二氫鉀 KH2PO4 分子量136.09 天津市天大化工實驗廠</p&g

52、t;<p>　　碳酸氫鈉 NaHCO3 分子量84.01 上海虹光化工廠</p><p>　　乙二胺四乙酸二鈉 Na2EDTA 分子量372.24 南京化學試劑一廠</p><p>　　考馬斯亮藍R-250粉末 國藥集團化學試劑有限公司</p><p&g

53、t;　　無水乙醇 天津市科密歐化學試劑有限公司</p><p>　　鹽酸 南京化學試劑一廠</p><p>　　冰醋酸 國藥集團化學試劑有限公司</p><p&

54、gt;　　重蒸水 實驗室自制</p><p>　　四甲基乙二胺（TEMED） 上海楷洋生物技術(shù)有限公司</p><p>　　過硫酸銨（AP） AMRESCO</p><

55、p>　　十二烷基磺酸鈉(SDS) 北京中聯(lián)化工試劑廠</p><p>　　巰基乙醇 AMRESCO</p><p>　　溴酚藍 AMRESCO&

56、lt;/p><p>　　蔗糖 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　丙烯酰胺（Acr） 鞏義金源化工有限公司</p><p>　　N,N’-亞甲雙丙烯酰胺(Bis) AMRE

57、SCO</p><p>　　三羥甲基氨基甲烷（Tris） 上海生工</p><p>　　甘氨酸 北京拜爾迪生物公司</p><p>　　標準蛋白

58、 西諾生物科技公司</p><p>　　雙氧水 國藥集團化學試劑有限公司</p><p><b>　　2.1.3 儀器</b></p><p>　　SZ-93自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠</p><p

59、>　　SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠</p><p>　　ZGX—300C智能光照培養(yǎng)箱 杭州錢塘江設(shè)備有限公司</p><p>　　LD5-2A低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠</p><p>　　托盤天平

60、 北京大柵欄天平廠</p><p>　　YP2001N電子天平 上?？茖W精密有限公司</p><p>　　78—1加熱磁力攪拌器 常州國華電器有限公司</p><p>　　UV-754 紫

61、外可見光光度計 山東高密彩虹分析儀器有限公司</p><p>　　超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司</p><p>　　日立CR22G冷凍高速離心機 日本HITACHI公司</p><p>　　電熱恒溫干燥箱

62、 連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠</p><p>　　DYY—2C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 南京高新技術(shù)校園生物所</p><p>　　PHS-2F PH計 上海精密科學儀器有限公司</p><p>　　50uL微量注射器

63、 上海安亭微量進樣廠</p><p>　　DY-B2脫色搖床 江蘇省興化市分析儀器廠</p><p>　　夾心式垂直板電泳槽（電泳槽，玻璃板，膠條，電泳梳子） 北京六一廠</p><p>　　冰箱 青島海爾股份有限公司

64、</p><p>　　超低溫保存冰箱 青島海爾股份有限公司</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 鹽藻的培養(yǎng)</p><p>　　鹽藻生長培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中進行。培養(yǎng)溫度白天為25℃,夜間20℃。光照與黑暗的比

65、為12h∶12h。白天光照強度3500lx。培養(yǎng)20d后,進行培養(yǎng)結(jié)果的分析比較。</p><p>　　2.2.2 鹽藻細胞SOD的粗提取</p><p><b>　　(1)離心</b></p><p>　　取培養(yǎng)好的藻液400mL，用兩層細紗布過濾后，均等份倒入離心管中離心(4000rmp，5min)，離心完立即棄上清液，取其沉淀。溶解于5

66、0ml 20mM pH 7.6 PBS緩沖液中。</p><p><b>　　(2)破碎</b></p><p>　　將離心獲得的藻細胞液在超低溫冰箱中反復凍融3次，再用超聲波破碎儀破碎3min（超聲波破碎儀的輸出率調(diào)至60%，功率調(diào)至50%），取破碎后的藻液混勻后于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其細胞已完全破碎。最后將已破碎的藻液以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，得到

67、的上清液即為鹽藻細胞SOD的粗提取液。測定其酶活后將其保存于-35℃下，以備進一步處理時使用。</p><p>　　2.2.3 SOD的分離純化</p><p><b>　　(1)丙酮處理</b></p><p>　　分別取粗酶液3.5ml于3支試管中，將置于-35℃冰箱中預凍好的丙酮以體積比為0.4v/v的量加入試管中。輕輕攪勻，將試管置于

68、4℃冰箱中緩慢攪拌2h。10000rpm 離心20min，取沉淀溶解于3.5 ml 20mM PH 7.6 PBS緩沖液中。</p><p><b>　　(2)熱處理</b></p><p>　　分別取粗酶液3.5ml于3支試管中，置于70℃的溫度下加熱10min，10000rpm 離心20min，棄沉淀。</p><p>　　(3)測定經(jīng)丙酮

69、沉淀和熱處理后的SOD的酶活和蛋白含量。</p><p>　　2.2.4 SOD的純度鑒定和分子量測量方法</p><p>　　用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法對SOD進行純度鑒定和分子量測量。鹽藻細胞蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑的配制：</p><p>　　(1)不連續(xù)體系SDS-PAGE有關(guān)試劑</p><p>　?、?0%SDS

70、溶液：稱5gSDS，加重蒸水至50mL，微熱使其溶解，置試劑瓶中，室溫保存。SDS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解。</p><p>　　②1%TEMED：取0.1mLTEMED，加重蒸水至10mL，置棕色瓶中，4℃貯存。</p><p>　　③10%AP：稱AP0.1g，加重蒸水至1mL。最好臨用前配制。</p><p>　　④樣品溶解液：內(nèi)含1%SDS，

71、1%巰基乙醇，40%蔗糖，0.02%溴酚藍，0.01mol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液。</p><p>　　先配制0.05mol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液：稱Tris（三羥甲基氨基甲烷）0.6g，加入50mL重蒸水，再中入約3mL1mol/L的HCl，調(diào)pH至8.0，最后用重蒸水定容至100mL。</p><p>　　按表1配制樣品溶解液。</p>

72、<p>　　表1 不連續(xù)體系樣品溶解液配制</p><p>　　*如樣品為液體，則應(yīng)用濃一倍的樣品溶解液，然后等體積混合。</p><p>　　⑤凝膠貯液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水定溶至100mL，用0.45μL/0.22mm的濾膜過濾，置于棕色瓶中4 ℃貯存，可使用一個月左右。</p><p>

73、;　?、弈z緩沖液：分離膠緩沖液（1.5mol/L pH8.8的Tris-HCl緩沖液）：稱Tris18.15g，加約80mL重蒸水，用1mol/LHCl調(diào)pH至8.8，用重蒸水稀釋定容至100mL，4 ℃貯存。</p><p>　　濃縮膠緩沖液（0.5mol/L pH6.8的Tris-HCl緩沖液）：稱Tris6.0g，加約60mL重蒸水，用1mol/L HCl調(diào)pH至6.8，用重蒸水稀釋定容至100

74、mL，4℃貯存。</p><p>　?、唠姌O緩沖液（pH8.3）：Tris3.0g，甘氨酸14.4g，SDS1 g，加重蒸水使其溶解后，定容至1000mL，4 ℃貯存。</p><p><b>　?。?）染色液</b></p><p>　　0.25g考馬斯亮藍R250，加入91mL50%甲醇，9mL冰醋酸。過濾備用。</p>&l

75、t;p><b>　?。?）脫色液</b></p><p>　　醫(yī)用酒精：冰醋酸：重蒸水=4.5：0.5：5（V/V/V）</p><p><b>　?。?）分離膠的制備</b></p><p>　　本實驗采用10%的分離膠。按表2進行配制。</p><p>　　表2 10%的分離膠系統(tǒng)的組成

76、</p><p>　　按照表2的配比，先將貯液、水、分離膠緩沖液、SDS以及TEMED混合，置真空干燥器中抽氣10分鐘。</p><p>　　然后加入過硫酸銨，輕輕混勻后，迅速用移液槍吸取分離膠，沿壁緩緩注入已準備好的膠室中，膠液加到離梳子底部1.0厘米處。注膠后應(yīng)立即覆蓋 3-5 毫米的水層，垂直靜止聚合60分鐘左右。聚合后將覆蓋的水層倒出，并用潔凈濾紙吸干。</p>&l

77、t;p><b>　　（5）濃縮膠的制備</b></p><p>　　濃縮膠的濃度為5%。按表3進行配制。</p><p>　　表3 5%的濃縮膠系統(tǒng)的組成</p><p>　　按照表3的配比，先將貯液、水、分離膠緩沖液、SDS以及TEMED混合，置真空干燥器中抽氣10分鐘，然后加入過硫酸銨，輕輕混勻后,迅速用移液槍吸取濃縮膠注入已聚合并

78、吸凈上層水的分離膠的界面上。濃縮膠應(yīng)充滿膠室，這時將梳板插入，注意梳齒邊緣不能帶入氣泡，室溫下靜置約60min即聚合。</p><p>　　（6）樣品蛋白的處理</p><p>　　取一個EP管加入200μL樣品溶解液，同時加入200μL蛋白樣品溶液，輕輕的蓋上蓋子，于沸水浴中保溫3min，同時以同樣的條件處理標準蛋白。</p><p>　　沸水浴結(jié)束后，取出樣品搖

79、勻，冷卻至室溫，4 ℃離心，12000r/min，5min，收集上清液，用于加樣。標準蛋白分子量分別為100 KD、75 KD、50 KD、32KD、25 KD、15 KD。</p><p><b>　?。?）染色與脫色</b></p><p>　　電泳結(jié)束后，倒出電極緩沖液。取出凝膠玻璃板，撬開短玻璃板，在凝膠上切下一角作為加樣標志，小心將凝膠從玻璃板上取下，放入一

80、大培養(yǎng)皿中。加染色液染色60min，傾出染色液，用蒸餾水漂洗數(shù)次后，加入脫色液于脫色搖床上脫色。數(shù)小時更換一次脫色液。直至背景清晰。</p><p>　　脫色完成后，使用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行拍照，保存照片，以待分析。</p><p>　　（8）相對分子量的計算</p><p>　　用直尺分別量出溴酚藍、標準蛋白、待測蛋白質(zhì)區(qū)帶中心距分離膠頂端的距離。</p&

81、gt;<p>　　把溴酚藍遷移的距離定為d1（cm），蛋白質(zhì)遷移的距離定為d2（cm），按下式計算出各種蛋白質(zhì)的遷移率Rm：</p><p>　　Rm = d2/d1</p><p>　　根據(jù)蛋白質(zhì)在電泳當中其分子量的對數(shù)值(1gM)與其相對遷移距率(Rm)呈比例關(guān)系的原理，以標準蛋白質(zhì)Mr的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標準曲線。根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標準曲線上查出

82、其相對分子質(zhì)量。</p><p>　　2.2.5 SOD酶活與蛋白質(zhì)含量測定方法</p><p>　　(1) SOD酶活測定方法</p><p>　　鄰苯三酚自氧化速率的測定[20]：在10mL試管中加人PH值為7.6的20mM磷酸緩沖液2.99mL，在25±0.5 ℃的恒溫水浴中保溫10 min，然后加入在25±0.5℃的恒溫水浴中事先預熱好

83、的50 mM鄰苯三酚溶液10μL (空白管用10mM HCI代替)，迅速搖勻倒人1 cm比色皿中，以空白管為參比，在325nm 下，每隔30S測 1次吸光值，連續(xù)記錄4min，調(diào)節(jié)鄰苯三酚溶液用量，將其自氧化速率控制在0.07(±0.002)D/min。經(jīng)實驗測得鄰苯三酚溶液的用量為8μL。</p><p>　　樣品活性的測定：在10mL 試管中加人PH值為7.6的20 mmol/L磷酸緩沖溶液2.98

84、mL 和10μL的樣液，在25±0.5℃的恒溫水浴中保溫10min，然后加人在25±0.5℃的恒溫水浴中事光預熱好的鄰苯三酚溶液8μL (空白管用10mM HCI代替)，迅速搖勻倒人1 cm比色皿中，以空白管為參比，在325nm 下，每隔30S測 1次吸光值，連續(xù)記錄4min，根據(jù)公式計算酶活：</p><p>　　抑制率I（%）=100%</p><p>　　SOD活

85、性（U/ml）=</p><p>　　式中:ΔOD1/ min —鄰苯三酚自氧化速率</p><p>　　ΔOD2/ min —加入樣品后氧化速率</p><p>　　如果對樣品進行稀釋，最后結(jié)果要乘以稀釋倍數(shù)。</p><p>　　(2) 蛋白質(zhì)含量測定方法</p><p>　　分別在280nm和260nm的紫外光下

86、測定蛋白質(zhì)的A280、A260。根據(jù)下列公式計算藻液中的蛋白質(zhì)含量[35]：</p><p>　　蛋白質(zhì)含量(mg/mL)=1.55A280-0.76A260 。 </p><p>　　(3) 比活力的計算方法</p><p>　　比活力的計算如公式：比活力（U/ mg）=酶活（U/mL）/蛋白質(zhì)含量(mg/mL)</p><p>　　2.

87、2.6 鹽藻SOD的分子類型鑒定</p><p>　　（1）最大吸收波長的確定：分別在紫外和可見光范圍內(nèi)進行波譜掃描，通</p><p>　　過相關(guān)文獻確定樣品SOD類型。</p><p>　?。?）H2O2對SOD的抑制作用：通過測定不同濃度下H2O2對鹽藻SOD的</p><p>　　酶活性的影響確定樣品SOD的類型。本實驗中H2O2的

88、濃度采用2.5%，5%，7.5%，</p><p>　　10%四個濃度梯度，加入100μL樣液后測定H2O2對SOD的抑制率，從而判斷樣</p><p><b>　　液SOD的類型。</b></p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 鹽藻SOD的分離純化結(jié)果

89、</p><p>　　3.1.1 鄰苯三酚自氧化速率</p><p>　　鄰苯三酚自氧化速率如圖1所示。由圖1可知，在 0.5～4 min 范圍內(nèi)，隨著時間的增加，鄰苯三酚的吸光度呈線性增加，即鄰苯三酚的自氧化速率與時間變化呈正相關(guān)。經(jīng)實驗測定，在加入鄰苯三酚 8μL時，4 min 內(nèi)鄰三酚自氧化速率變化值為 0.0718 ，在 0.070 (±0.002) 范圍之內(nèi)，符合要求

90、。</p><p>　　3.1.2 樣品SOD酶活性的相關(guān)測定</p><p>　　通過對從鹽藻中提取的粗酶液以及經(jīng)過丙酮沉淀和熱處理的SOD酶液進行酶活性質(zhì)的測定，本實驗得到如下結(jié)果，見表4</p><p>　　表4 鹽藻SOD分離純化結(jié)果</p><p>　　*以粗酶液的蛋白含量為基準，后面處理每一步所測的蛋白質(zhì)含量除以粗酶液的蛋白含量

91、×100%即為回收率。</p><p>　　**以粗酶液的比活力為基準，后面處理每一步所測的比活力除以粗酶液的比活力×100%即為純化倍數(shù)。</p><p>　　由表4可以看出經(jīng)過分離純化，由于雜蛋白被除去，所得溶液中蛋白質(zhì)含量明顯降低。丙酮沉淀處理使蛋白沉淀，同時由于SOD分子具有一定的耐高溫性，高溫處理使其它的雜蛋白質(zhì)變性沉淀，被除去，純化倍數(shù)達到了11.30倍&l

92、t;/p><p>　　3.2 鹽藻SOD的純度檢測與分子量測定</p><p>　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS(十二烷基磺酸鈉)，SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復合物，這種復合物由于結(jié)合大量的

93、SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。如圖2鹽藻SOD電泳圖。</p><p>　　圖2樣品SOD電泳圖</p><p>　　本實驗通過9次電泳結(jié)果表明，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中只出現(xiàn)一條帶，說明經(jīng)過

94、以上的分離純化，鹽藻SOD已經(jīng)達到電泳純。根據(jù)其遷移率計算得分子量為23.1KD。</p><p>　　由吳夏，王旻的研究[36]，蘆薈中Cu/Zn-SOD分子量為21.7KD,大蒜中Cu/Zn-SOD分子量為26.6KD,仙人球中Cu/Zn-SOD分子量為36.2KD。不同的生物中SOD的分子結(jié)構(gòu)略有差別。本實驗中測得鹽藻中SOD的分子量為23.1KD，可以初步推斷為Cu/Zn-SOD，是否含有其它類型的SOD

95、需要進一步研究。</p><p>　　3.3 鹽藻SOD的種類鑒定</p><p>　　3.3.1 樣品SOD吸收光譜</p><p>　　(1)紫外吸收光譜測定</p><p>　　根據(jù)SOD所結(jié)合的金屬原子的不同,植物 SOD可分為三種類型：Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD。不同種類的SOD其吸收光譜各不相同。據(jù)文獻[3

96、7 ,38 ]報道,牛血Cu/Zn-SOD的紫外最大吸收峰為258 nm ,大豆Cu/Zn-SOD 為265.4 nm ,鴨紅細胞Cu/Zn-SOD 為258 nm。Mn-SOD和Fe-SOD的紫外最大吸收峰為280 nm。本實驗中，經(jīng)測定鹽藻SOD的紫外吸收波普如圖3所示。</p><p>　　一般蛋白質(zhì)最大紫外吸收波長在280 nm左右,由于SOD酶蛋白分子中不含色氨酸,酪氨酸含量也極低,最大紫外吸收在260

97、 nm 左右是各種來源的Cu/Zn-SOD的共同特征。由圖3可見，鹽藻SOD的最大紫外吸收波長為259nm。通過對三種SOD最大紫外吸收峰的比較可以初步推斷出鹽藻SOD為Cu/Zn-SOD。</p><p>　?。?）可見吸收光譜測定</p><p>　　已有文獻報道Fe-SOD在可見光區(qū)的最大吸收值在350納米，Mn-SOD在可見光區(qū)的最大吸收值在475納米，Cu/Zn-SOD在可見光區(qū)

98、的最大吸收值在680納米處，通過對鹽藻樣品SOD在可見光區(qū)的波譜掃描，其吸收光譜曲線如圖4 所示。</p><p>　　由圖4可以看出樣品SOD最大吸收峰出現(xiàn)在671nm，與文獻中報道的680nm有所出入，但遠離Fe-SOD和Mn-SOD的最大吸收峰波長，較為接近Cu/Zn-SOD的最大吸收峰波長。因為不同植物所含SOD在結(jié)構(gòu)上存在差異，故使得實驗結(jié)果與報道的結(jié)果有所出入。至于SOD結(jié)構(gòu)的差異性有待進一步的研究。

99、</p><p>　　3.3.2 H2O2對樣品SOD的抑制作用</p><p>　　由于H2O2能夠?qū)е翪u/Zn-SOD和Fe-SOD的失活，而不能使Mn-SOD失活，所以可通過計算抑制率判斷相應(yīng)的SOD類型。計算公式如下：</p><p>　　抑制率I（%）=100%</p><p>　　式中:ΔOD1/ min —鄰苯三酚自氧化速率

100、</p><p>　　ΔOD2/ min —加入樣品后氧化速率</p><p>　　本實驗中，純化酶液中加入H2O2，SOD的活性測定計算結(jié)果見表5。</p><p>　　表5 加入H2O2后樣液SOD對鄰苯三酚的抑制率</p><p>　　由表5 可以看出加入H2O2后，SOD酶活力下降，而且隨著H2O2濃度的增加，SOD酶活力的下降十分

101、明顯。即樣液中SOD對鄰苯三酚的抑制降低，說明H2O2對SOD的抑制作用明顯增強。由鹽藻樣品SOD的吸收曲線及H2O2對SOD的抑制作用，我們可以進一步證明樣品中含有Cu/Zn-SOD。</p><p><b>　　結(jié) 論</b></p><p>　　本實驗對鹽藻細胞SOD的分子特性進行了初步探索，從鹽藻細胞中分離出一種SOD分子，對其進行了凝膠電泳鑒定，并進一步進

102、行了分子類型的初步鑒定?？梢猿醪酵茢帑}藻細胞中含有Cu/Zn-SOD，是否含有其它類型的SOD仍需要進一步研究。因此，通過本實驗的初步探索可為鹽藻細胞SOD分子特性方面的研究提供一定的實驗基礎(chǔ)。</p><p><b>　　本次實驗結(jié)果表明：</b></p><p>　　(1)樣品SOD的分子量為23.1KD，查閱文獻，可以初步推斷為Cu/Zn-SOD。</p&

103、gt;<p>　　(2)通過樣液SOD在紫外光區(qū)的光譜曲線和在可見光區(qū)的光譜曲線可以初步認為鹽藻中的SOD為Cu/Zn-SOD。</p><p>　　(3)通過對H2O2對SOD的抑制作用可以進一步證實鹽藻樣液SOD 為Cu/Zn-SOD。</p><p>　　通過凝膠電泳鑒定只有一條帶，結(jié)合樣液SOD 的光譜曲線以及H2O2對SOD的抑制作用可以判斷鹽藻中含有Cu/Zn-S

104、OD。</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　本實驗在選題、準備、實驗具體操作以及論文的寫作與定稿的整個過程中得到了郭金耀老師的悉心指導。在實驗的開始階段，遇到一些困難，由于郭老師的指導與幫助，我順利制定好了一個較合理的實驗方案。實驗中，郭老師嚴謹、實事求是的治學作風和堅持不懈的科研態(tài)度，淵博的科研知識，以及平易近人的態(tài)度對我產(chǎn)生了很大的影

105、響。郭老師不僅給對我的實驗給予了很大幫助，同時也讓我懂得了許多做學問和做人的道理，讓我受益匪淺。在此，向郭老師表示衷心的感謝。</p><p>　　在實驗過程中楊曉玲老師也給予我不少指導，給我實驗帶來了很多幫助，在此表示感謝。</p><p>　　另外，還要感謝劉筱瀟、管習超、崔龍昌等同學，給我的實驗能夠順利進行帶來了不可缺少的幫助。感謝和我同在一個實驗室的所有同學對我的幫助。感謝生化實驗

106、室薛婉麗老師對我的幫助。</p><p>　　對所有幫助和關(guān)心過我的同學和老師表示衷心的感謝！</p><p><b>　　參 考 文 獻</b></p><p>　　[1] 李亞清,張華微,楊海波等. 杜氏藻 （Dunaliella sp.）多糖DPS21 的提取分離純化和糖基組成分析[J].海洋環(huán)境科學,2008,27（3）∶217.&l

107、t;/p><p>　　[2] 李鋼,鄧運濤,任剛等.鹽生杜氏藻3—磷酸甘油脫氫酶基因克隆及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測[J].植物學通報,2006,23（1）∶29-36.</p><p>　　[3] 張福,馬若欣,呂愛玲等.極端嗜鹽綠色杜氏藻生物學特性研究(一)[J].海湖鹽與化工,2005,34（1）∶26-27.</p><p>　　[4] 林廣鳳.鹽生杜氏藻的生物學特

108、性及其開發(fā)應(yīng)用[J].齊魯漁業(yè),2006,23（11）∶7.</p><p>　　[5] 古玉環(huán),陳軍.鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）的生物學特性與培養(yǎng)研究[J].西北師范大學學報自然科學版 ,1995,314∶52.</p><p>　　[6] 郭健.杜氏藻培養(yǎng)生產(chǎn)β-胡蘿卜素研究進展[J].農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā),2001,（5）∶4-6.</p><p

109、>　　[7] 楊雪梅,吳超元.鹽藻的研究與開發(fā)[J].生命科學,1994 ,6（5）∶7 -10.</p><p>　　[8] Beu-A.Avron M. In Cresswell RC,et al.Alga and Cyanobacterial Biotechnology[M].1969∶91.</p><p>　　[9] Ginzburg M.Adu Botanical R