澇漬脅迫下玉米葉片蛋白質(zhì)組學分析.pdf

1、玉米是一種重要的經(jīng)濟作物，全世界每年的玉米產(chǎn)量因為洪澇災害而受到嚴重的影響。本研究通過人工模擬澇漬傷害，對玉米幼苗進行澇漬脅迫。通過澇漬脅迫條件下玉米葉片總蛋白的提取、二維熒光差異凝膠電泳對玉米幼苗葉片進行蛋白差異性表達的分析，并從細胞程序性死亡的角度研究澇漬脅迫下玉米幼苗對澇漬脅迫的適應機制。
　　玉米幼苗在55cm×35cm×10cm盆中生長到四葉期后進行澇漬脅迫處理，然后測定基礎(chǔ)生理指標。其中葉綠素含量，最大光化學效率，葉片

2、相對含水量及葉片水勢在脅迫后的葉片中呈下降趨勢，DI0/RC（單位反應中心耗散的能量）呈上升趨勢;在澇漬脅迫4天后，第一第二葉比第三第四葉表現(xiàn)出更嚴重的脅迫響應。同時檢測到H2O2在澇漬脅迫三天后開始爆發(fā)。澇漬脅迫四天后，玉米幼苗第三葉檢測到明顯的DNA片段化，據(jù)此判定澇漬脅迫在玉米葉片中誘導了細胞程序性死亡(Programmedcelldeath,PCD)。
　　依據(jù)上述脅迫條件下各葉片的生理生化變化，以澇漬脅迫4天后的玉米幼苗

3、第三葉為實驗材料提取葉片總蛋白，利用二維熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)及MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)對脅迫響應蛋白進行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)32個蛋白點在脅迫后的表達發(fā)生顯著變化(與脅迫前相比，蛋白表達差異＞2.5倍且具備統(tǒng)計學顯著性，p-value＜0.05)，其中18個蛋白點上調(diào)，14個蛋白點下調(diào)。在這些差異蛋白點中，成功鑒定了28個蛋白點，包括10個與光合作用及能量代謝相關(guān)的蛋白（其中有4個點鑒定為同一蛋白），9個與PCD相關(guān)的

4、蛋白（其中有兩個點鑒定為同一蛋白）以及5個與激素、多胺有關(guān)的蛋白。與PCD相關(guān)的蛋白多為PCD調(diào)控因子，包括防御相關(guān)蛋白3-β羥固醇脫氫酶家族蛋白(3-betahydroxysteroiddehydrogenase/isomerasefamilyprotein)、殼多糖酶(Chitinase)和Harpin結(jié)合蛋白，及50S核糖體蛋白L21(50SribosomalproteinL21)、pleckstrin同源域家族A(pleckst

5、rinhomologydomaincontaining，familyA)、DREPP4蛋白、fruitproteinPKIWI502、熱激蛋白70和假定的熱激蛋白-翻譯控制腫瘤蛋白(translationally-controlledtumorprotein)。其中熱激蛋白70在澇漬脅迫下的上調(diào)表達顯示了植物細胞對PCD這一主動死亡過程的平衡控制。我們對其中一個PCD相關(guān)蛋白，假定的熱激蛋白Translationally-control

6、ledtumorprotein(TCTP)開展了進一步研究。組織特異性表達檢測發(fā)現(xiàn)，TCTP基因在水稻根、莖、葉中的表達量依次遞減。通過熱激誘導水稻懸浮細胞原生質(zhì)體PCD、暗誘導擬南芥及水稻幼苗葉片衰老、煙草花葉病毒侵染煙草葉片組織誘導超敏反應等不同類型的PCD，利用熒光定量PCR檢測TCTP的轉(zhuǎn)錄水平時發(fā)現(xiàn)，在熱激誘導水稻原生質(zhì)體PCD過程中，TCTP轉(zhuǎn)錄水平的顯著上升滯后于DNA片段化。在TMV侵染煙草葉片誘導超敏反應的過程中，TC

7、TP基因在7h時表達顯著上升，而超敏反應標志基因hsr203J在侵染后5h表達即上升。在暗誘導水稻幼苗葉片衰老的過程中，在葉片開始黃化的36h，伴隨類caspase-3活性的上升，TCTP的表達量顯著上升，但在類caspase-3活性處于最大值時的48h，TCTP的表達已出現(xiàn)下降。與此相反，在暗誘導擬南芥幼苗葉片衰老的過程中，TCTP基因的表達量始終呈上升趨勢。序列分析表明，水稻和玉米TCTP蛋白同源性較高(79.64％)，而與擬南芥同

8、源性較低(76.05％)，水稻和擬南芥的同源性較低(76.19％)。研究結(jié)果表明，TCTP與植物PCD密切相關(guān)，但具體的調(diào)節(jié)方式在水稻和擬南芥中可能并不相同。在5個與激素、多胺相關(guān)的蛋白中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶2（SAMS2）與乙烯和多胺合成相關(guān)，控制葉角蛋白（controlleafangleprotein），PISTILLATA-likeMADSboxprotein參與乙烯介導的信號轉(zhuǎn)導，轉(zhuǎn)錄因子HRT(Hordeumrepress

9、oroftranscription)抑制GA誘導的基因表達，AUX/IAAprotein參與生長素的信號傳導。對內(nèi)源激素含量的測定表明，澇漬脅迫下內(nèi)源乙烯及ABA的含量增加，GA和IAA的含量下降。澇漬脅迫后在玉米葉片內(nèi)未檢測到ACC合成相關(guān)基因的表達，而多胺合成相關(guān)基因表達上調(diào)且腐胺和精胺含量顯著增加。據(jù)此，SAMS2表達上調(diào)是澇漬脅迫下玉米葉片內(nèi)多胺含量上升的主要原因，而轉(zhuǎn)錄因子HRT在GA含量下降的過程中發(fā)揮重要的輔助作用。