澇漬脅迫下玉米葉片蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、玉米是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，全世界每年的玉米產(chǎn)量因?yàn)楹闈碁?zāi)害而受到嚴(yán)重的影響。本研究通過人工模擬澇漬傷害，對(duì)玉米幼苗進(jìn)行澇漬脅迫。通過澇漬脅迫條件下玉米葉片總蛋白的提取、二維熒光差異凝膠電泳對(duì)玉米幼苗葉片進(jìn)行蛋白差異性表達(dá)的分析，并從細(xì)胞程序性死亡的角度研究澇漬脅迫下玉米幼苗對(duì)澇漬脅迫的適應(yīng)機(jī)制。
　　玉米幼苗在55cm×35cm×10cm盆中生長到四葉期后進(jìn)行澇漬脅迫處理，然后測定基礎(chǔ)生理指標(biāo)。其中葉綠素含量，最大光化學(xué)效率，葉片

2、相對(duì)含水量及葉片水勢在脅迫后的葉片中呈下降趨勢，DI0/RC（單位反應(yīng)中心耗散的能量）呈上升趨勢;在澇漬脅迫4天后，第一第二葉比第三第四葉表現(xiàn)出更嚴(yán)重的脅迫響應(yīng)。同時(shí)檢測到H2O2在澇漬脅迫三天后開始爆發(fā)。澇漬脅迫四天后，玉米幼苗第三葉檢測到明顯的DNA片段化，據(jù)此判定澇漬脅迫在玉米葉片中誘導(dǎo)了細(xì)胞程序性死亡(Programmedcelldeath,PCD)。
　　依據(jù)上述脅迫條件下各葉片的生理生化變化，以澇漬脅迫4天后的玉米幼苗

3、第三葉為實(shí)驗(yàn)材料提取葉片總蛋白，利用二維熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)及MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)脅迫響應(yīng)蛋白進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)32個(gè)蛋白點(diǎn)在脅迫后的表達(dá)發(fā)生顯著變化(與脅迫前相比，蛋白表達(dá)差異＞2.5倍且具備統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，p-value＜0.05)，其中18個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)，14個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)。在這些差異蛋白點(diǎn)中，成功鑒定了28個(gè)蛋白點(diǎn)，包括10個(gè)與光合作用及能量代謝相關(guān)的蛋白（其中有4個(gè)點(diǎn)鑒定為同一蛋白），9個(gè)與PCD相關(guān)的

4、蛋白（其中有兩個(gè)點(diǎn)鑒定為同一蛋白）以及5個(gè)與激素、多胺有關(guān)的蛋白。與PCD相關(guān)的蛋白多為PCD調(diào)控因子，包括防御相關(guān)蛋白3-β羥固醇脫氫酶家族蛋白(3-betahydroxysteroiddehydrogenase/isomerasefamilyprotein)、殼多糖酶(Chitinase)和Harpin結(jié)合蛋白，及50S核糖體蛋白L21(50SribosomalproteinL21)、pleckstrin同源域家族A(pleckst

5、rinhomologydomaincontaining，familyA)、DREPP4蛋白、fruitproteinPKIWI502、熱激蛋白70和假定的熱激蛋白-翻譯控制腫瘤蛋白(translationally-controlledtumorprotein)。其中熱激蛋白70在澇漬脅迫下的上調(diào)表達(dá)顯示了植物細(xì)胞對(duì)PCD這一主動(dòng)死亡過程的平衡控制。我們對(duì)其中一個(gè)PCD相關(guān)蛋白，假定的熱激蛋白Translationally-control

6、ledtumorprotein(TCTP)開展了進(jìn)一步研究。組織特異性表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，TCTP基因在水稻根、莖、葉中的表達(dá)量依次遞減。通過熱激誘導(dǎo)水稻懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體PCD、暗誘導(dǎo)擬南芥及水稻幼苗葉片衰老、煙草花葉病毒侵染煙草葉片組織誘導(dǎo)超敏反應(yīng)等不同類型的PCD，利用熒光定量PCR檢測TCTP的轉(zhuǎn)錄水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，在熱激誘導(dǎo)水稻原生質(zhì)體PCD過程中，TCTP轉(zhuǎn)錄水平的顯著上升滯后于DNA片段化。在TMV侵染煙草葉片誘導(dǎo)超敏反應(yīng)的過程中，TC

7、TP基因在7h時(shí)表達(dá)顯著上升，而超敏反應(yīng)標(biāo)志基因hsr203J在侵染后5h表達(dá)即上升。在暗誘導(dǎo)水稻幼苗葉片衰老的過程中，在葉片開始黃化的36h，伴隨類caspase-3活性的上升，TCTP的表達(dá)量顯著上升，但在類caspase-3活性處于最大值時(shí)的48h，TCTP的表達(dá)已出現(xiàn)下降。與此相反，在暗誘導(dǎo)擬南芥幼苗葉片衰老的過程中，TCTP基因的表達(dá)量始終呈上升趨勢。序列分析表明，水稻和玉米TCTP蛋白同源性較高(79.64％)，而與擬南芥同

8、源性較低(76.05％)，水稻和擬南芥的同源性較低(76.19％)。研究結(jié)果表明，TCTP與植物PCD密切相關(guān)，但具體的調(diào)節(jié)方式在水稻和擬南芥中可能并不相同。在5個(gè)與激素、多胺相關(guān)的蛋白中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶2（SAMS2）與乙烯和多胺合成相關(guān)，控制葉角蛋白（controlleafangleprotein），PISTILLATA-likeMADSboxprotein參與乙烯介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄因子HRT(Hordeumrepress

9、oroftranscription)抑制GA誘導(dǎo)的基因表達(dá)，AUX/IAAprotein參與生長素的信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)內(nèi)源激素含量的測定表明，澇漬脅迫下內(nèi)源乙烯及ABA的含量增加，GA和IAA的含量下降。澇漬脅迫后在玉米葉片內(nèi)未檢測到ACC合成相關(guān)基因的表達(dá)，而多胺合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)且腐胺和精胺含量顯著增加。據(jù)此，SAMS2表達(dá)上調(diào)是澇漬脅迫下玉米葉片內(nèi)多胺含量上升的主要原因，而轉(zhuǎn)錄因子HRT在GA含量下降的過程中發(fā)揮重要的輔助作用。