膽管癌的蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、膽管癌(cholangiocarcinoma)是一種難于早期診斷和治療的惡性腫瘤。目前，大多數(shù)的膽管癌病人發(fā)現(xiàn)時病程已進(jìn)入晚期，多已失去手術(shù)機(jī)會。而目前尚缺乏敏感的放療、化療手段，能否早期診斷并進(jìn)行根治性治療成為影響本病預(yù)后的最主要因素。近年來，膽道腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已引起越來越多的學(xué)者重視。因此，加強(qiáng)膽道腫瘤的生物學(xué)特性研究，深入探討膽道腫瘤的發(fā)生機(jī)制，并尋求有效的早期診斷指標(biāo)和治療方法，對于提高膽道腫瘤的療效和預(yù)后具有重

2、要意義。 高通量的雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種生物研究領(lǐng)域，成為研究生物靶標(biāo)的一種重要的手段。近年來由于血清在臨床診斷中的核心地位，人血清蛋白組學(xué)越來越引起各界的興趣，血清中的蛋白濃度與它的生理功能密切相關(guān)，如免疫反應(yīng)、小分子轉(zhuǎn)運(yùn)、炎癥和脂類代謝。功能上的缺失和濃度上的失衡都可能是由疾病造成或是引發(fā)疾病。 本文將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于膽管癌研究，尋找膽管癌早期診斷的標(biāo)志和病理機(jī)制線索。篩選和研究膽管癌組織和血清中

3、的特異性標(biāo)記物，以期尋找到膽管癌早期診斷的指標(biāo)。在腫瘤的發(fā)生早期就可以在蛋白水平出現(xiàn)細(xì)微但重要的改變，致使組織細(xì)胞內(nèi)部和血清等體液中可能含有大量未發(fā)現(xiàn)的可用作疾病物的蛋白和多肽。 通過對雙向電泳體系的一些環(huán)節(jié)的優(yōu)化如組織蛋白的提取，血清中白蛋白/IgG的去除方法，上樣量的選擇，PH梯度的選擇、電泳參數(shù)的設(shè)置、凝膠濃度和SDS凝膠電泳染色方法等進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明結(jié)織樣品經(jīng)液氮研磨后丙酮沉淀，血清經(jīng)ProteoExtract Al

4、bumin/IgG Removal Kit處理后，得到高質(zhì)量的樣品。并且在pH3.5-10和pH5.8的兩性電解質(zhì)載體以體積比1：4混合的情況下，以100μg的上樣量，6400 v.h的電泳條件下，初步建立了膽管癌組織和血清的雙向電泳體系。并且得到了分辨率較好的膽管癌組織和血清的差異蛋白表達(dá)圖譜。進(jìn)一步通過ImageMaster2D軟件分析圖譜，找出膽管癌癌部位與癌旁組織，膽管癌病人血清和健康人血清的差異表達(dá)蛋白。并對其進(jìn)行膠內(nèi)酶解后經(jīng)

5、MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到差異表達(dá)蛋白的PMF圖譜。最后利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)在網(wǎng)上進(jìn)行檢索鑒定差異蛋白質(zhì)。 在兩組凝膠上約發(fā)現(xiàn)了約268個差異表達(dá)的蛋白點，實驗組是癌旁正常組織的電泳圖譜，對照組是膽管癌病灶區(qū)的電泳圖譜。同樣地，在膽管癌病人與健康對照組全血清和處理后的血清中也分別發(fā)現(xiàn)了18對和40對差異蛋白點。我們將其中顯著差異的蛋白點提交質(zhì)譜分析，最終發(fā)現(xiàn)膽管癌病灶中有13種蛋白上調(diào)，11種蛋白下調(diào)。同時也發(fā)現(xiàn)全血與處

6、理后血清中分別有6種和5種蛋白上調(diào)或特異表達(dá)。7種和5種蛋白下調(diào)或缺失。這些蛋白中上調(diào)的主要有：細(xì)胞角蛋白、熱休克蛋白、膜聯(lián)蛋白等；表達(dá)下調(diào)的蛋白主要有：鋅指蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白、免疫球蛋白等。并且討論和推測了這些蛋白的功能和抑制腫瘤增殖的機(jī)制。 通過免疫印跡實驗，本文進(jìn)一步驗證了Annexin V蛋白的差異表達(dá)。即AnnexinV蛋白在膽管癌組織和血清中高表達(dá)。本部分的結(jié)果表明：基于凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)方法適用于膽管癌組織和血清樣品的