玉米耐旱相關(guān)基因ZmHSP90-1和ZmMYB-R1的序列特征分析與功能驗(yàn)證.pdf

1、干旱是長(zhǎng)期以來(lái)影響全世界糧食產(chǎn)量的主要限制因素之一。預(yù)計(jì)世界人口在2050年將會(huì)超過(guò)90億，今后相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)人口和資源的矛盾會(huì)相當(dāng)突出。隨著近現(xiàn)代遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，采用基因工程培育優(yōu)良的耐旱作物勢(shì)在必行。挖掘耐旱基因進(jìn)行序列和功能分析，以期研究耐旱性分子機(jī)理，為創(chuàng)造耐旱新種質(zhì)提供新基因資源，進(jìn)而選育耐旱玉米等作物。玉米(Zea mays L.)不僅是重要的糧食和飼料作物，也是重要的食品工業(yè)原料和能源植物。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)玉米總產(chǎn)已

2、經(jīng)超過(guò)小麥，成為我國(guó)第二大糧食作物。本研究以耐旱自交系玉米為供試材料，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中獲得的耐旱相關(guān)ESTs，分析篩選出一些脅迫應(yīng)答基因，并克隆了兩個(gè)新的基因，即熱激蛋白(heat-shock protein，HSP)基因ZmHSP90-1和轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMYB-R1。通過(guò)生物信息學(xué)分析、蛋白瞬時(shí)表達(dá)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR初步研究了ZmHSP90-1基因和轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMYB-R1在非生物脅迫中的響應(yīng)機(jī)制；通過(guò)在擬南芥中過(guò)量表

3、達(dá)該基因分析目標(biāo)基因的抗逆功能。
　　 本研究主要研究成果如下：⑴將72條耐旱相關(guān)ESTs的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較和功能分析，其中60條ESTs在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到了同源基因，大多數(shù)的基因與非生物脅迫及生物脅迫相關(guān)，發(fā)掘了兩個(gè)新的基因：熱激蛋白基因ZmHSP90-1和轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMYB-R1。另外12條ESTs不能找到匹配基因，待采用RACE等分子生物學(xué)手段進(jìn)行基因全長(zhǎng)克隆和生物學(xué)功能研究。⑵克隆了一個(gè)新的熱激蛋

4、白基因ZmHSP90-1，該基因編碼697個(gè)氨基酸，編碼的蛋白包括ATPase位點(diǎn)和HSP90保守結(jié)構(gòu)域。蛋白比對(duì)和聚類分析表明，ZmHSP90-1與擬南芥、水稻等多種物種的熱激蛋白高度同源，與擬南芥的AtHSP90.1親緣關(guān)系比較近，蛋白序列相似性達(dá)到88.3％。蛋白瞬時(shí)表達(dá)顯示ZmHSP90-1在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示，ZmHSP90-1基因的表達(dá)受多種非生物脅迫的誘導(dǎo)，且在不同脅迫處理下表達(dá)模式不同，但在高溫和高鹽下的

5、表達(dá)模式有些類似，推測(cè)在這兩個(gè)脅迫條件下玉米植株所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)中可能存在通路。⑶構(gòu)建了在擬南芥中過(guò)表達(dá)ZmHSP90-1基因的重組載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法獲得了數(shù)十個(gè)具有潮霉素抗性的陽(yáng)性植株，經(jīng)PCR檢測(cè)及后續(xù)的篩選總共獲得14個(gè)株系。轉(zhuǎn)ZmHSP90-1，基因擬南芥種子萌發(fā)和根長(zhǎng)受NaCl脅迫抑制，幼苗和成株期忍耐高溫、干旱、ABA、CaCl2的能力都有不同程度的提高，但是對(duì)NaCl脅迫各個(gè)株系表現(xiàn)并不一致。⑷克隆了轉(zhuǎn)錄因子

6、ZmMYB-R1基因，該基因編碼626個(gè)氨基酸，含有單一的MYB區(qū)域，屬于R1-MYB類型轉(zhuǎn)錄因子。蛋白比對(duì)和聚類分析表明ZmMYB-R1與AtMYB3、OsMYB2的親緣關(guān)系比較近。蛋白瞬時(shí)表達(dá)顯示ZmMYB-R1在細(xì)胞核特異性表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明ZmMYB-R1基因的表達(dá)，受到高溫、高鹽、ABA、低溫、干旱的誘導(dǎo)，且不同脅迫處理下該基因的表達(dá)模式不同。構(gòu)建了在擬南芥中過(guò)表達(dá)ZmMYB-R1基因的重組載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的