對(duì)褐飛虱高毒力的真菌菌株篩選及其應(yīng)用研究.pdf

1、褐飛虱Nilaparvata lugens Sta1是我國(guó)及東南亞地區(qū)一種遠(yuǎn)距離遷飛性水稻重要害蟲。為了尋求對(duì)該蟲生物防治的新途徑，本論文在既有資料的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選對(duì)褐飛虱高毒力的真菌菌株，系統(tǒng)研究了所得高毒力黃綠綠僵菌Metarhiziumflavoviride(Mf)菌株的生物學(xué)特性、對(duì)褐飛虱不同蟲態(tài)的毒力以及致病機(jī)理，研制了該菌株乳懸劑劑型，并對(duì)黃綠綠僵菌(Mf)菌株的固相發(fā)酵培養(yǎng)基組分的配方進(jìn)行了優(yōu)化，為防治褐飛虱真菌殺蟲劑

2、的開發(fā)與規(guī)?；a(chǎn)提供有價(jià)值的技術(shù)資料。本研究主要獲得以下結(jié)果：
　　 1、從褐飛虱N.lugens罹病蟲體上新分離出的一種黃綠綠僵菌菌株M.flavoviride(Mf)，與實(shí)驗(yàn)室保存的黃綠綠僵菌、金龜子綠僵菌和白僵菌3種菌種5個(gè)菌株作對(duì)比，研究了在SDAY和PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀，并測(cè)定了它們對(duì)褐飛虱成蟲的毒力。結(jié)果表明：在SDAY培養(yǎng)基上，6個(gè)菌株菌落特征差異明顯，Mf菌株菌落直徑增長(zhǎng)量最大，產(chǎn)孢量最高，分別為2.59m

3、m，17.34×107孢子/cm2。與其它菌株相比差異顯著。Mf菌株在SDAY培養(yǎng)基上生生長(zhǎng)優(yōu)于PDA，Mf菌株對(duì)褐飛虱成蟲具有很強(qiáng)的毒力，以1.0×108孢子/mL，的孢子液接種到褐飛虱成蟲體表上，累積校正死亡率達(dá)83.8％，LT50為4.47 d，致死率明顯高于其他真菌。
　　 2、用分子生物學(xué)主方法對(duì)褐飛虱成蟲高毒力真菌菌株進(jìn)行了鑒定。采用氯化芐法、CTAB法以及裂解液法分別提取了該菌的基因組DNA；以ITS1和ITS4為

4、綠僵菌通用引物，對(duì)供試菌株的rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和序列分析，并在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明裂解液法提取的該種綠僵菌的基因組DNA純度高且質(zhì)量好，氯化芐法次之，CTAB法不適合提取此菌的基因組DNA；分子鑒定結(jié)果顯示該菌為綠僵菌屬黃綠綠僵菌(M.flavoviride)。明確侵染褐飛虱的綠僵菌種類，進(jìn)而掌握其生物學(xué)征和對(duì)寄主的致病性。
　　 3、對(duì)新分離鑒定黃綠綠僵菌Mf82菌

5、株，將其與實(shí)驗(yàn)室保存的8株綠僵菌M.spp。一起，分別測(cè)定其對(duì)褐飛虱成蟲毒力和幾丁質(zhì)酶活力，并用掃描電鏡觀察了Mr82菌株侵入昆蟲表皮的過(guò)程和體表的形態(tài)變化，進(jìn)而分析侵入能力與幾丁質(zhì)酶的相關(guān)性。結(jié)果表明：菌株Mf82累計(jì)校正死亡率和幾丁質(zhì)酶活力均最高，為82.1％和9.78 U/mg，與其他菌株差異顯著。同時(shí)，掃描電鏡照片顯示Mr82分生孢子既可以由褐飛虱體壁節(jié)間膜和凹陷處侵入，還可以從含幾丁質(zhì)較多的胸部背板侵入，可見(jiàn)篩選的Mr82菌株

6、對(duì)褐飛虱成蟲致病力強(qiáng)。比較9株綠僵菌菌株菌落生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢初始時(shí)間、產(chǎn)孢量和萌發(fā)率顯示，Mf82菌株具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢初始時(shí)間短、萌發(fā)率高和產(chǎn)孢量大等優(yōu)點(diǎn)。
　　 4、利用黃綠綠僵菌m.flvoviride82菌株五種濃度5296-5368、1055-1121、585-623、126-144和22-31孢子/mm2侵染不同齡期褐飛虱成蟲和若蟲并以1100孢子/mm2孢子懸浮液侵染褐飛虱懷卵雌成蟲、雌成蟲、雄成蟲和不同齡期卵。結(jié)

7、果表明：其不同濃度孢子液對(duì)褐飛虱3個(gè)發(fā)育階段有不同程度的致病力，毒力大小順序?yàn)槌上x>高齡若蟲>低齡若蟲。同時(shí)，Mr82菌株對(duì)不同性別褐飛虱成蟲的敏感性順序?yàn)閼崖汛瞥上x>雌成蟲>雄成蟲。黃綠綠僵菌孢子液對(duì)各處理稻株褐飛虱產(chǎn)卵痕部位、卵粒均有侵染作用，10 d侵染率分別為66.7％和51.2％，卵齡越低，侵染效果越好，卵齡為0.5 d時(shí)侵染率最高。本研究表明黃綠綠僵菌。Mr82菌株對(duì)褐飛虱成蟲、若蟲和卵均有較強(qiáng)的致病性，
　　 5、

8、利用掃描電鏡觀察了黃綠綠僵菌M.flvoviride菌株分生孢子對(duì)褐飛虱的侵染過(guò)程。結(jié)果表明：分生孢子多分布在褐飛虱節(jié)間膜、體表的褶皺凹陷等部位，主要以芽管或產(chǎn)生附著胞入侵，然后在體表長(zhǎng)出菌絲和產(chǎn)孢。菌體進(jìn)入寄主血腔后，利用體腔內(nèi)營(yíng)養(yǎng)大量增殖、擴(kuò)散并侵染褐飛虱卵巢中的卵塊。侵染卵塊的菌絲雖被體液包裹但依然能繼續(xù)生長(zhǎng)，使卵粒失活，抑制害蟲下代的數(shù)量。通過(guò)體表及體內(nèi)的侵染過(guò)程，可直觀地表現(xiàn)黃綠綠僵菌對(duì)褐飛虱的侵染能力和侵入方式，為評(píng)價(jià)該菌的

9、殺蟲作用和應(yīng)用前景提供了證據(jù)。
　　 6、用新分離出的黃綠綠僵菌M.flvoviride(Mr82)菌株與實(shí)驗(yàn)室保存的黃綠綠僵菌、金龜子綠僵菌和白僵菌3種菌種9個(gè)菌株作對(duì)比，測(cè)定了它們的懸乳劑對(duì)褐飛虱成蟲的毒力。結(jié)果表明：Mf82菌株對(duì)褐飛虱成蟲的毒力最高，以1.0×108個(gè)孢子/mL的孢子懸乳劑噴霧接種到褐飛虱成蟲體表上，累積死亡率高達(dá)81.7％，LT50為4.6d，致病效果顯著高于其他受測(cè)菌株。在此基礎(chǔ)上研制了黃綠綠僵菌懸乳

10、劑，并研究了其對(duì)褐飛虱的致病力。結(jié)果表明：隨著黃綠綠僵菌濃度的增加，褐飛虱的累計(jì)死亡率增加，在濃度為1048個(gè)孢子/mm2時(shí)，累計(jì)死亡率達(dá)到85.0％。利用時(shí)間.劑量-死亡率模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所建模型均順利通過(guò)Hosmer-Lemeshow擬合異質(zhì)性檢驗(yàn)，表明模型擬合良好，并由模型估計(jì)出了該劑型對(duì)褐飛虱的致死劑量與致死時(shí)間。在接種后第7 d和第9 d，LC50值分別為2.1×103、9.9×102個(gè)孢子/mm2，LC90分別為7.8x

11、104、3.7×104個(gè)孢子/mm2。黃綠綠僵菌懸乳劑對(duì)褐飛虱的致死時(shí)間與對(duì)數(shù)劑量相關(guān)，供試菌劑LT50值隨著對(duì)數(shù)劑量的增加而遞減，對(duì)數(shù)劑量由7.0增加到8.0時(shí)，LT50由8.9 d降為5.7 d?？梢?jiàn)該黃綠綠僵菌懸乳劑對(duì)褐飛虱具有較強(qiáng)的毒力。
　　 7、以大米粉、黃粉蟲蛹?xì)?、花生殼和瓜子殼為培養(yǎng)基組成成分，研究黃綠綠僵菌固相發(fā)酵最佳配方。在固相發(fā)酵條件下，利用Design-Expert軟件分析各因素對(duì)產(chǎn)孢量的顯著性，采用響應(yīng)

12、面法對(duì)黃綠綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行研究和優(yōu)化。結(jié)果表明：影響產(chǎn)孢量的顯著成分為黃粉蟲蛹?xì)?；黃綠綠僵菌發(fā)酵最佳配方組合為：0.25 g大米、0.14 g黃粉蟲蛹?xì)ぁ?.00 g花生殼、0.25 g瓜子殼。在此最佳組合為培養(yǎng)基的條件下得到產(chǎn)孢量為100.013×108個(gè)/mL菌液，比初始設(shè)計(jì)提高了31.7％。使用本研究?jī)?yōu)化后的培養(yǎng)基配方，可以降低生產(chǎn)成本，得到較高產(chǎn)量的孢子，且在生產(chǎn)時(shí)無(wú)環(huán)境污染，對(duì)以后的大規(guī)模生產(chǎn)非常有利。