菊花近緣種屬植物抗寒性評(píng)價(jià)及抗寒分子機(jī)制研究.pdf

1、菊花(Chrysanthemum grandiflorum(Ramat.) Kitam.），作為世界四大切花和我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，具有很高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在花卉生產(chǎn)中占有重要地位。然而，我國(guó)長(zhǎng)江中下游及長(zhǎng)江以北地區(qū)的冬季低溫嚴(yán)重影響了菊花生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致觀賞品質(zhì)下降，成為限制我國(guó)菊花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。開(kāi)展菊花抗寒育種、培育抗寒新品種，是解決這一問(wèn)題的根本途徑。菊花近緣種屬野生種質(zhì)資源常具有栽培品種缺乏的某些抗逆性，對(duì)拓寬菊花種質(zhì)資源

2、和基因庫(kù)有重要應(yīng)用價(jià)值。因此，開(kāi)展菊花近緣種屬野生種質(zhì)資源的抗寒篩選，獲得典型抗寒材料，探索其抗寒生理及分子機(jī)制，有利于加快推動(dòng)菊花抗寒種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育進(jìn)程。本文的研究?jī)?nèi)容及主要結(jié)論如下:
　　 1.對(duì)45份菊花近緣種屬野生資源的抗寒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)合冬季腳芽葉片半致死溫度(LT50)，將抗寒性進(jìn)行分類(lèi)，強(qiáng)抗寒（LT50＜-20℃）:紫花野菊、沈陽(yáng)野菊、異色菊、太行菊和北京植物園野菊等;中等抗寒（-20℃≤LT50≤-10℃

3、）:黃金艾蒿、成都峰峽野菊、菊花腦等;不抗寒(LT50＞-10℃):若峽濱菊、神龍架野菊和達(dá)摩菊等。進(jìn)一步通過(guò)腳芽恢復(fù)生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)腳芽冷凍處理后的存活率與LT50呈顯著負(fù)相關(guān)，表明半致死溫度可作為菊花近緣種屬抗寒性評(píng)價(jià)的一個(gè)可靠指標(biāo)。
　　 2.以強(qiáng)抗寒異色菊和不抗寒若峽濱菊為材料，分析了冷馴化(4℃，1d、7d、14d和21d)條件下的抗寒差異。隨著冷馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)菊屬植物的半致死溫度LT50呈現(xiàn)不同程度的下降

4、;其中抗寒性強(qiáng)的異色菊從-7.3℃下降到-23.5℃，而抗寒性弱的若峽濱菊從-2.1℃下降到-7.1℃。測(cè)定了冷馴化過(guò)程中抗氧化酶(SOD、CAT和APX)活性和脯氨酸含量的變化，根據(jù)生物信息學(xué)從菊花EST數(shù)據(jù)庫(kù)中電子克隆了抗氧化同工酶基因(Cu/Zn SOD、Fe SOD、Mn SOD、CAT和APX)、脯氨酸代謝相關(guān)基因（P5CS、OAT和PDH）以及冷調(diào)節(jié)相關(guān)基因（2個(gè)DREB家族基因、2個(gè)COR413家族基因和2個(gè)CSD家族基因

5、），并進(jìn)行了定量表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷馴化使SOD、CAT和APX活性和脯氨酸含量的提高，其中異色菊提高的幅度顯著高于若峽濱菊;基因表達(dá)分析顯示SOD活性的提高主要來(lái)源于MnSOD的表達(dá)增強(qiáng)，CAT和APX表達(dá)與其酶活性變化一致，P5CS和PDH表達(dá)與脯氨酸含量變化趨勢(shì)一致;異色菊MnSOD、CAT、APX和P5CS表達(dá)的上升幅度顯著高于若峽濱菊。冷調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，冷馴化誘導(dǎo)了DREBs、COR413s和CSDs基因表達(dá)的

6、上調(diào)，其中異色菊的上升幅度均顯著高于若峽濱菊。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，冷馴化初期抗寒性的提高來(lái)源于抗氧化系統(tǒng)的變化、脯氨酸含量的積累和冷調(diào)節(jié)基因的表達(dá)的綜合作用，冷馴化后期抗寒性的提高來(lái)源于Mn SOD，COR413s和CSDs等抗寒基因的表達(dá)的上調(diào)。
　　 3.DREB家族基因在植物抗寒調(diào)控中發(fā)揮重要作用，為了進(jìn)一步研究DREB基因的上游調(diào)控路徑，從異色菊中分離到一個(gè)DREB家族基因CdDREBa的啟動(dòng)子序列，其位于翻譯起始位點(diǎn)上游1

7、474 bp的區(qū)域，PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子中包括很多脅迫相關(guān)順式作用元件（MYC-box，MYB-site，GT-1和W-box）。通過(guò)啟動(dòng)子融合β-葡萄糖苷酸酶基因在擬南芥中表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)不同5'缺失的CdDREBa啟動(dòng)子在低溫和鹽脅迫下的活性存在差異。GUS組織化學(xué)染色和定量檢測(cè)結(jié)果顯示，啟動(dòng)子中一段80 bp（-430～-351 bp）的序列同時(shí)受低溫和鹽脅迫響應(yīng)。將這個(gè)80 bp的片段與35S mini啟動(dòng)子融合表達(dá)，顯

8、著促進(jìn)了鹽脅迫下GUS基因的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)內(nèi)部缺失方法，發(fā)現(xiàn)一個(gè)低溫抑制元件位于-430～-390 bp區(qū)域和一個(gè)鹽誘導(dǎo)元件位于-385～-351 bp區(qū)域。結(jié)果顯示，啟動(dòng)子中除了已知的MYC-box和GT-1元件受低溫和鹽脅迫響應(yīng)外，我們發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)響應(yīng)元件區(qū)域在脅迫響應(yīng)過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用。
　　 4.ICE家族基因在冷馴化調(diào)控植物抗寒路徑中至關(guān)重要，以異色菊為材料，分離到一個(gè)ICE家族同源基因CdICE1，編碼471個(gè)

9、氨基酸，序列分析與其他物種ICEs具有高度相似性。通過(guò)熒光定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，低溫、鹽和ABA均誘導(dǎo)了CdICE1基因的表達(dá);進(jìn)一步克隆了CdICE1啟動(dòng)子，位于翻譯起始位點(diǎn)上游1682 bp的區(qū)域，序列分析發(fā)現(xiàn)了很多脅迫相關(guān)作用元件。構(gòu)建35S∷CdICE1-GFP表達(dá)載體，基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CdICE1定位于細(xì)胞核。采用畢赤酵母真核分泌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)CdICE1蛋白進(jìn)行表達(dá)并純化，凝膠阻滯(EMSA)試驗(yàn)證明CdI

10、CE1蛋白能與CdDREBa啟動(dòng)子中的MYC元件特異結(jié)合;酵母單雜交試驗(yàn)證明CdICE1具有轉(zhuǎn)錄激活活性。這些初步表明，異色菊中存在ICE1-DREB調(diào)節(jié)路徑。
　　 5.為了進(jìn)一步證明CdICE1的抗寒調(diào)控功能，將CdICE1基因轉(zhuǎn)到擬南芥中，并進(jìn)行抗凍表型分析和分子機(jī)制探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溫度馴化均提高了擬南芥抗凍性，異源表達(dá)異色菊CdICE1基因顯著提高了不同溫度馴化下抗凍性。23-4℃馴化下，CdICE1促進(jìn)了CBFs及

11、下游COR15a、COR6.6和RD29a三個(gè)抗凍基因的表達(dá)，與擬南芥AtICE1基因功能相似;而在23-16℃馴化條件下，CdICE1促進(jìn)了三個(gè)抗凍基因的小幅上調(diào)，而對(duì)CBFs表達(dá)沒(méi)有影響。23-16℃馴化誘導(dǎo)了miR398的下調(diào)，促進(jìn)了CSD1和CSD2的上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR398負(fù)向調(diào)控?cái)M南芥抗凍性，而CSDs正向調(diào)控抗凍性;miR398-CSDs路徑參與了23-16℃馴化誘導(dǎo)的抗凍性調(diào)節(jié)。CdICE1過(guò)量表達(dá)顯著下調(diào)了23

12、-16℃馴化后miR398的表達(dá);CdICE1介導(dǎo)了miR398-CSDs路徑，提高抗凍性。因此，不同溫度馴化下，CdICE1通過(guò)兩條不同路徑調(diào)控?cái)M南芥抗凍性。
　　 6.大量研究證明ICE1蛋白存在轉(zhuǎn)錄后的翻譯修飾，為了深入研究CdICE1的調(diào)控機(jī)制，應(yīng)用酵母雙雜交體系對(duì)CdICE1互作蛋白進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，采用Clontech試劑盒，成功構(gòu)建了對(duì)照和冷馴化下菊花葉片eDNA混合酵母文庫(kù)，以pGBKT7-CdICE1-85