芽孢桿菌染色體編輯系統(tǒng)構建及三種抗真菌物質合成的遺傳調控研究.pdf

1、土傳病原真菌對經濟作物構成的危害和造成的損失是限制現代高效農業(yè)發(fā)展的重要因素之一。為了克服這種連作生物障礙，土壤消毒劑和化學農藥的使用量越來越大。然而，農藥的過度使用引起了廣泛的病原菌耐藥性和嚴重的環(huán)境污染?；瘜W農藥在土傳植物病害防控方面的缺陷和消費者對無公害或綠色及有機食物逐漸擴大的需求，使得基于拮抗微生物的土傳病害生物防控技術逐步替代化學農藥而成為更有前景的作物安全管理策略。芽孢桿菌是一種重要的、已被廣泛應用的促生和生防菌劑，但目前

2、其遺傳操作系統(tǒng)還不成熟，對芽孢桿菌抗真菌物質合成的遺傳調控的研究還不夠深入。
　　 本論文建立了一種可以快速高效對芽孢桿菌進行多次基因改造的染色體編輯系統(tǒng)，研究了三株生防菌枯草芽孢桿菌ATCC6633、多粘類芽孢桿菌SQR21和產綠鏈霉菌ATCC29814產生抗真菌物質的分子機理。
　　 為了配合生防菌基因改良涉及的大量基因重組工作，本論文構建了一種基于Beta重組酶和Cre重組酶的芽孢桿菌染色體編輯系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)可以

3、將敲除元件的單鏈PCR產物直接轉化菌體實現基因失活，重組所需的同源臂很短僅70-nt，可以直接由引物提供。初步篩選得到的陽性轉化子經過42℃培養(yǎng)激活Cre重組酶刪除敲除元件。該系統(tǒng)所用的輔助質粒pWY121為溫度敏感質粒，50℃培養(yǎng)抑制質粒復制進而將其消除。
　　 利用該芽孢桿菌染色體編輯系統(tǒng)對枯草芽孢桿菌ATCC6633脂肽類抗生素mycosubtilin合成基因簇進行刪除，使ATCC6633失去了拮抗真菌的能力，而對基因ab

4、rB的敲除能顯著提高其mycosubtilin的產量。通過構建ATCC6633/Pmyc-lacZ報告系統(tǒng)篩選ATCC6633染色體cosmid文庫中能誘導該系統(tǒng)在X-gal平板上顯示藍色的克隆，采用基因敲除和基因表達等手段最終確定了ComX對mycosubtilin的合成具有正調控的作用。
　　 通過對多粘類芽孢桿菌SQR21進行轉座誘變，篩選到一株對病原真菌Fusariumoxysporum完全失去拮抗能力的突變體MUT-8

5、。LC/MS分析確定了MUT-8失去合成拮抗物質fusaricidin的能力。通過比對分析發(fā)現轉座子插入區(qū)域位于菌株SQR21的fusA上。fusA基因編碼一個完整的閱讀框，該閱讀框包含有6個非核糖體合成酶模塊。盡管fusaricidin結構上第六位的氨基酸都被報道為D-型丙氨酸，基因分析發(fā)現對應的模塊并沒有使氨基酸發(fā)生異構化的組件。推測模塊6的氨基酸活化域可以直接識別D-型丙氨酸。通過生物信息學分析，推測fusA上游的fusGFEDC

6、B負責fusaricidin脂肪酸鏈的合成。利用lacZ報告系統(tǒng)和凝膠阻滯電泳確定了AbrB能結合fusaricidin基因簇的啟動子Pfus并抑制其表達。利用芽孢桿菌染色體編輯系統(tǒng)敲除了菌株SQR21的abrB基因，突變體抗真菌能力有明顯的提高。
　　 利用全基因組測序技術可以對產綠鏈霉菌ATCC29814環(huán)脂肽類抗生素laspartomycin的疑似合成基因簇進行定位，然而由于缺乏對該菌進行基因突變的遺傳操作工具，對于該疑似

7、合成基因簇的功能確定和突變分析一直難以實現。本論文構建了自殺型載體pATKK，并建立了相應的轉化方法，成功敲除了該疑似合成基因簇的lpmC基因。對應的突變體失去了合成laspartomycin的能力，證明疑似合成基因簇參與laspartomycin的合成。將lpmC基因序列與菌株ATCC29814的全基因組序列進行比對與序列分析，發(fā)現laspartomycin合成基因簇長約60 kb，包含了21個開放閱讀框。有趣的是laspartomy

8、cin基因簇包含了編碼稀有氨基酸二氨基丁酸(Dab)的dabA，dabB和dabC基因，盡管laspartomycin在結構上并不舍有二氨基丁酸。
　　 結論:通過轉座子隨機誘變技術、定向突變技術以及全基因組測序等技術，發(fā)現了mycosubtilin的表達受到轉錄調控因子AbrB的抑制和胞外信息素ComX的激活;確定了兩種抗真菌物質fusaricidins和laspartomycins的編碼基因簇，利用生物信息學分析了相關基因的