芽孢桿菌促生抑菌物質鑒定及機理研究.pdf

1、根際促生細菌（PGPR）是指生存在根際范圍內，對植物生長有促進或對病原菌有拮抗作用的有益細菌的統(tǒng)稱。目前已報道的促生機制包括提高氮、磷等營養(yǎng)元素的可利用性，分泌生長素、分裂素、赤霉素等植物激素，產生ACC脫氨酶降低植物體內乙烯含量，產生2，3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮等揮發(fā)性物質等。芽孢桿菌是一類重要的根際促生細菌，由于其能產生抗逆性強的芽孢、對環(huán)境和人畜安全等特性而被廣泛地應用于實際生產中。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌OKB10

2、5能夠促進煙草和水稻等植物生長、提高煙草對花葉病毒的抗性，還可以用于防治根結線蟲病，但是其促生和生防機制尚不完全清楚。本研究通過與水稻互作的枯草芽孢桿菌OKB105表達譜數(shù)據(jù)分析，結合其突變體文庫篩選，確定芽孢桿菌促生相關基因，再對這些基因進行定點突變和功能回復，結合構建突變體、高效液相色譜、Real-time PCR、Elisa等技術確定該促生物質和其促生機理。此外，本研究還評估了芽孢桿菌揮發(fā)性物質對水稻白葉枯病菌（Xanthomon

3、as oryzae pv.oryzae）的抑菌效果，鑒定出具有抑菌活性的揮發(fā)性物質，并研究其抑菌機理。主要研究結果如下:
　　1.枯草芽孢桿菌OKB105能夠明顯促進水稻株高的生長，促生效果為25.2％。為了揭示其促生機制，對與水稻互作2h的枯草芽孢桿菌OKB105的表達譜進行分析。結果表明，與水稻互作后共有176個基因的表達水平發(fā)生差異變化，占枯草芽孢桿菌OKB105轉錄組的3.8％。針對其功能已知的122個差異表達的基因進行功

4、能分析，主要涉及新陳代謝、轉運、運動性、趨化性等方面，其中4組基因受水稻影響最大，分別是:與碳水化合物、氨基酸代謝及轉運相關的基因;與轉錄調控子相關的基因;與產孢、運動性、趨化性相關的基因以及與糖醛酸磷壁酸生物合成相關基因。這些結果表明在芽孢桿菌與植物互作的過程中:(1)芽孢桿菌能夠利用植物分泌的物質作為碳源和氮源;(2)芽孢桿菌能夠感受周圍環(huán)境的變化作出反應，提高自身的競爭力;(3)植物能夠通過向芽孢桿菌提供能量來間接的影響其產孢及細

5、胞壁成分等。通過表達譜芯片技術分析了與水稻互作后的OKB105差異表達基因，為進一步揭示植物與芽孢桿菌的互作機制打下基礎。
　　2.同時對枯草芽孢桿菌OKB105促生活性物質的基本特性進行研究，發(fā)現(xiàn)這種促生物質熱穩(wěn)定，且分子量＜3kDa。隨后對構建的OKB105突變體文庫中的700個突變體進行篩選，篩選出4個同時對煙草和水稻促生缺陷的突變體。隨后通過反向 PCR等技術對4個突變體中轉座子的插入位點進行鑒定，發(fā)現(xiàn)4個被突變基因分別為

6、:yecA基因編碼假定的氨基酸/多胺透性酶;yusV基因編碼Fe(Ⅲ)-嗜鐵素轉運蛋白，與Fe(Ⅲ)攝取相關;sigH基因編碼RNA聚合酶sigma H因子;comX基因編碼信息素前體，與感受態(tài)形成相關。結合表達譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)表達譜數(shù)據(jù)中差異表達的speA基因和本章篩選出的yecA基因都與多胺相關。speA基因編碼精氨酸脫羧酶，參與多胺的生物合成，ecA則與多胺轉運有關。因此，推測枯草芽孢桿菌OKB105對植物的促生活性與多胺有關。

7、>　　3.為了證實這一猜測，構建了yecA和speB的定點突變體，編碼假定的氨基酸/多胺透性酶的yecA基因和編碼胍丁胺酶的speB基因分別參與枯草芽孢桿菌OKB105的多胺分泌和生物合成過程，這兩個基因的破壞都會導致OKB105促生能力的缺陷，而speB的功能回復體則會恢復其對植物的促生效果。隨后結合衍生及HPLC技術對OKB105及其突變體的發(fā)酵上清液進行分析，確定亞精胺是OKB105促進植物生長的關鍵物質。同時用不同濃度人工合成的

8、亞精胺浸種處理煙草，發(fā)現(xiàn)5-100μM的亞精胺確實能夠促進煙草根的生長。通過Real-time PCR檢測煙草體內促生相關基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)OKB105、speB功能回復體和5μM亞精胺處理過的煙草的擴張蛋白基因Nt-EXPA1和Nt-EXPA2上調表達，乙烯合成相關基因ACO1下調表達，而ELISA結果同樣證明OKB105、speB功能回復體和亞精胺處理能夠明顯降低煙草葉片的乙烯含量。這些結果表明OKB105分泌的亞精胺在一定程度上

9、通過誘導擴張蛋白相關基因的表達和抑制乙烯的合成來促進植物的生長。首次證實了芽孢桿菌通過分泌亞精胺促進植物生長，揭示了芽孢桿菌促生的一種新機制。
　　4.本論文還對芽孢桿菌揮發(fā)性物質的抑菌活性進行了評估。首先對50株芽孢桿菌揮發(fā)性物質的抑細菌活性進行篩選，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌OKB105和蠟樣芽孢桿菌D13產生的揮發(fā)性物質能夠明顯抑制水稻白葉枯病菌（Xoo）的菌落生長和細胞活性。通過掃描電鏡和透射電鏡技術對Xoo的外部形態(tài)和內部結構進行

10、分析，發(fā)現(xiàn)對照Xoo細胞壁光滑，細胞呈桿狀，而揮發(fā)性物質處理后的Xoo細胞壁凹陷，細胞變得畸形、膨脹或是皺縮，不呈桿狀，且細胞質濃縮。此外，D13揮發(fā)性物質處理能夠降低Xoo的致病力和抑制致病相關基因的表達。隨后，通過氣質聯(lián)用對OKB105和D13產生的揮發(fā)性物質進行分析，鑒定出OKB105產生的7個揮發(fā)性物質和D13產生的12個揮發(fā)性物質。其中，癸醇和3，5，5-三甲基己醇能夠抑制Xoo的生長，并且3，5，5-三甲基己醇對水稻細菌性條