麥族抗條銹病基因WKS的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用.pdf

1、小麥條銹病，俗稱“黃疸病”，在全世界范圍內(nèi)對(duì)小麥產(chǎn)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅。條銹病的防治可以通過(guò)抗病育種，品種合理布局，化學(xué)防治和適期播種等栽培措施來(lái)解決。其中抗病育種是最為合理，最為經(jīng)濟(jì)有效地防治方法，抗病育種主要包括抗病資源的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用。本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的1580份麥族種質(zhì)為材料，用已經(jīng)克隆的成株期高溫抗條銹病基因Yr36的功能標(biāo)記進(jìn)行了篩選，分析了野生二粒小麥中Yr36基因(也稱為Wheat Kinase-START 1，WKS1基因)的

2、等位變異；并用同源克隆的方法對(duì)野生二粒以外的WKS1和其同源基因WKS2(統(tǒng)稱WKS基因)進(jìn)行分離，將從長(zhǎng)穗偃麥草里克隆的WKS1基因轉(zhuǎn)化受體材料小麥品種Bobwhite進(jìn)行基因的功能分析；同時(shí)運(yùn)用分子標(biāo)記輔助育種的方法，將Yr10,Yr18和Yr36基因聚合到山東和河南的17個(gè)主栽小麥品種中，以期創(chuàng)造優(yōu)異的抗病種質(zhì)資源，改善黃淮冬麥區(qū)的抗病基因結(jié)構(gòu)。主要結(jié)果如下：
　　 1.用于篩選的麥族種質(zhì)材料包括普通小麥、合成小麥、粗山羊

3、草、野生一粒、野生二粒、大麥、頂芒山羊草、高大山羊草、沙融山羊草、簇毛麥、長(zhǎng)穗偃麥草、百薩薄冰草、鵝觀草。WKS基因只存在于野生種當(dāng)中，在栽培種均未檢測(cè)到。WKS1和WKS2僅同時(shí)在野生二粒中檢測(cè)到，255份野生二粒中170份含有WKS基因；WKS1在長(zhǎng)穗偃麥草和百薩薄冰草中檢測(cè)到；WKS2單獨(dú)存在于頂芒山羊草中，66份項(xiàng)芒山羊草中14份檢測(cè)到WKS2。
　　 2.根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)座子特異標(biāo)記，并對(duì)含有Yr36基因的野生二粒進(jìn)

4、行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有野生二粒中均含有LINE轉(zhuǎn)座子原件；同時(shí)利用Ecotilling技術(shù)對(duì)WKS基因的功能區(qū)域Kinase和START區(qū)域近行等位變異分析，均未檢測(cè)到等位變異位點(diǎn)，以上兩點(diǎn)說(shuō)明Yr36基因非常保守。
　　 3.用同源克隆的方法克隆了長(zhǎng)穗偃麥草、百薩薄冰草和頂芒山羊草中的WKS基因，序列分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)穗偃麥草、百薩薄冰草中WKS1的相似度達(dá)到99.69％，其cDNA與野生二粒WKS1之間的相似性達(dá)到了98.99％。頂芒山羊

5、草中的WKS2基因與野生二粒中的WKS2相似性達(dá)到96.34％。
　　 4.將長(zhǎng)穗偃麥草中的WKS1基因構(gòu)建表達(dá)載體，與含有Bar基因的質(zhì)粒用基因槍的方法進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的幼胚愈傷數(shù)為4197個(gè)，分化愈傷數(shù)1630個(gè)，再生苗1862株，除草劑Basta抗性苗206株，Bar基因陽(yáng)性苗119株，WKS1陽(yáng)性苗91株，結(jié)實(shí)單株20株。對(duì)來(lái)T1世代的9個(gè)株行的87棵單株進(jìn)行Bar基因和WKS1基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩基因間有分離，其中三棵只含

6、有WKS1基因。
　　 5.利用已經(jīng)克隆的三個(gè)不同類型的抗條銹病基因Yr10,Yr18和Yr36的功能分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)的652份普通小麥進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Yr10和Yr18存在于中國(guó)的各個(gè)麥區(qū)，其主要來(lái)源是南大2419，但是分布不均衡。Yr36基因中國(guó)小麥中均不存在。選取了山東和河南兩省17個(gè)品種，利用回交育種和分子聚合育種的方法，將該三個(gè)基因聚合到每一個(gè)材料當(dāng)中。目前，進(jìn)行到BC1F1代，在不同的遺傳背景下，三個(gè)抗病基因效果是不同的