不同倍性鯽鯉蛋白質代謝相關基因的克隆與表達研究.pdf

1、本實驗室在世界上首次制備了兩性可育的異源四倍體鯽鯉，該四倍體鯽鯉與二倍體紅鯽雜交獲得的三倍體湘云鯽具有明顯生長優(yōu)勢，分析認為主要與其不育有關。眾所周知，魚類生長主要通過機體蛋白質的合成來完成，蛋白質代謝直接影響魚類生長作用，外源蛋白在魚體內首先降解生成肽類物質和游離氨基酸，肽類物質在肽酶的作用下，進一步降解生成小肽和游離氨基酸，腸道轉運載體負責小肽和氨基酸的吸收，氨基酸在腸道或進入體內在肝臟發(fā)生代謝作用。因此，本研究克隆了影響不同倍性鯽

2、鯉蛋白質代謝的3個關鍵基因，并探討了其基因的表達特征，內容總結如下：
　　 1.氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)是一種從N末端酶切肽鏈的蛋白質消化酶，在蛋白質消化中發(fā)揮十分重要的作用。本研究克隆紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉APN的部分cDNA序列，結果表明不同倍性鯽鯉APN序列相對保守，系統(tǒng)進化樹顯示紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉親緣關系最近。實時定量PCR技術分析發(fā)現(xiàn)三倍體湘云鯽APN在腸道組織分

3、布最多，不同倍性鯽鯉APN基因具有母性遺傳特性，參與了早期胚胎發(fā)育各時期卵黃囊蛋白的消化，但三倍體湘云鯽APN在早期胚胎發(fā)育的多個時期均有較高的表達水平，說明在早期胚胎發(fā)育階段，三倍體湘云鯽對蛋白質的消化效率高于紅鯽，揭示了它對蛋白質代謝具有消化優(yōu)勢。
　　 2.小肽轉運載體(oligopeptide transporter，PepT1)是依賴質子的寡肽轉運載體(oligopeptide transporter，POT)家族成員

4、之一，腸道上皮細胞PepT1對蛋白質消化產物中的小肽吸收起關鍵性作用。本研究利用同源克隆和RACE方法克隆了紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉PepT1全長cDNA序列，結果表明三種倍性鯽鯉PepT1序列相對保守，氨基酸序列相似率在88.8～93.8之間，在第564個氨基酸位點，三倍體湘云鯽缺失一個氨基酸。利用實時定量PCR技術對湘云鯽組織表達檢測，結果表明三倍體湘云鯽PepT1主要分布在腸道前段，并沿腸道縱向表達量逐漸降低，說明了三倍

5、體湘云鯽腸道前段是蛋白質代謝產物中小肽的主要吸收場所。同樣，利用實時定量PCR技術對不同倍性鯽鯉早期胚胎發(fā)育不同時期進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，PepT1在不同倍性鯽鯉具有母性遺傳特性，三倍體湘云鯽PepT1在早期胚胎發(fā)育的多個時期有較高水平的表達，說明在早期胚胎發(fā)育階段，三倍體湘云鯽對蛋白質的吸收效率高于紅鯽，揭示了它對蛋白質代謝具有吸收優(yōu)勢。
　　 3.谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)是氨基酸代謝和糖代

6、謝的重要街接點之一，對氨基酸代謝有十分重要的作用。本研究克隆紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉GDH全長cDNA序列，結果表明三種魚GDH氨基酸序列高度保守。實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)不同倍性鯽鯉GDH廣泛分布在所有組織，在繁殖和非繁殖季節(jié)，三倍體湘云鯽肝臟組織GDHmRNA表達量均高于紅鯽。早期胚胎發(fā)育階段，GDHmRNA在三倍體湘云鯽表達量最高，說明在早期胚胎發(fā)育階段，三倍體湘云鯽對氨基酸的代謝效率高于紅鯽，揭示它具有氨基酸代謝優(yōu)勢。<

7、br>　　 4.研究了二倍體紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉生長、血清生化指標和蛋白質代謝相關基因表達的變化。每種倍性的魚設1個處理，每個處理三重復，投喂初始平均體重59.0g左右的同齡魚30天。結果表明三倍體湘云鯽增重率是二倍體紅鯽的2.13倍。湘云鯽相對紅鯽血清尿素氮、甲狀腺激素(T3、T4)濃度降低，谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶濃度升高，成體腸道APN、PepT1和肝臟GDH基因的表達量明顯升高，說明了在成體發(fā)育階段，湘云鯽具有明顯

8、蛋白質代謝優(yōu)勢。
　　 5.研究了蛋白質水平和種類對湘云鯽APN、PepT1、GDH基因表達的影響。配制了5種蛋白水平和2種蛋白種類的半精制飼料，每種飼料設1個處理，每個處理三重復，飼喂初始體重50g左右的同一批孵化湘云鯽40天，結果表明飼料蛋白水平和種類均能顯著影響湘云鯽腸道APN、GDH、PepT1基因的表達，湘云鯽APN基因的表達與腸道部位和蛋白濃度有相關性；蛋白水平主要影響湘云鯽中腸GDH基因的表達，其表達量隨蛋白水平增

9、加顯著上調(P<0.05)；低蛋白和高蛋白均能提高湘云鯽腸道PepT1基因的表達。魚粉相對豆粕而言，它能顯著提高湘云鯽腸道APN、GDH、PepT1基因的表達。
　　 6.研究了丁酸鈉對湘云鯽生長性能、血清生化指標及腸道APN、GDH、PepT1基因的表達的影響。在湘云鯽基礎飼料中添加5種不同劑量丁酸鈉，投喂49天，實驗結束時，測定其生長性能、血清生化指標和腸道APN、GDH、PepT1基因的表達豐度，結果表明隨丁酸鈉添加劑量的

10、增加，不同處理組對湘云鯽特定生長率先增大后減少，0.25g/kg丁酸鈉組湘云鯽特定生長率最高(21.12％)，餌料系數(shù)最低(2.03)，0.50g/kg丁酸鈉處理組湘云鯽的血清總蛋白(TP)最高，是對照組的2.47倍。谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)活性高于對照組，尿素氮(UN)濃度實驗組與對照組間差異不顯著(P>0.05)。添加劑丁酸鈉顯著提高湘云鯽腸道組織PepT1mRNA的表達，并呈劑量依賴效應。丁酸鈉調節(jié)湘云鯽腸道組織

11、APN表達特征是先下調后上調，調節(jié)GDH表達豐度特征是先上調后下調。
　　 7.研究了微生態(tài)制劑對湘云鯽生產性能和腸道GDH、APN和PepT1基因表達的影響，在湘云鯽基礎飼料中添加0.0g/kg、0.1g/kg、和0.2g/kg，投喂56天，實驗結束時，測定其生長性能和腸道APN、GDH、PepT1基因的表達豐度。結果表明0.1g/kg組湘云鯽增重率和特定生長率最高，極顯著高于對組照(p<0.01)，是對照組的1.47和1.2