生長調(diào)節(jié)劑及蔗糖濃度對(duì)彩葉草組織培養(yǎng)物迷迭香酸含量的影響.pdf

1、彩葉草(Coleus blumei)亦名斑葉洋紫蘇、錦紫蘇，歸唇形科鞘蕊花屬，是有著黃紅紫等各種色彩的柔嫩觀葉草本或亞灌木花卉，在印度、印尼、墨西哥等地被視作藥用植物。彩葉草中的主要次生代謝產(chǎn)物之一——迷迭香酸(Rosemarinic acid)是一種多酚羥基酸，具有抗氧化及清除自由基作用，并具有消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗抑郁等生物活性。本研究利用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)野生型彩葉草植株中迷迭香酸進(jìn)行了定性定量分析，并對(duì)迷迭香

2、酸在彩葉草根、莖、葉中的分布進(jìn)行了檢測(cè)，從四個(gè)彩葉草品種(hy1，hy2，hy3，hy4)中篩選得到了迷迭香酸含量較高的品種。以高迷迭香酸含量的彩葉草品種葉片為外植體，在含2％蔗糖的B5培養(yǎng)基中添加不同生長調(diào)節(jié)劑對(duì)其進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，初步確定了適合愈傷生長和迷迭香酸合成的培養(yǎng)基配方。將繼代多次得到的松散顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同肌醇濃度的上述改良B5液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，最終篩選得到適合細(xì)胞分散的懸浮培養(yǎng)基。用含有不同蔗糖濃度的改良B5

3、培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織和懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，研究蔗糖含量對(duì)培養(yǎng)物的生長和迷迭香酸合成的影響。同時(shí)，本研究還對(duì)羥基苯丙酮酸酯還原酶(HPPR)基因在彩葉草不同品種和不同組織中的表達(dá)情況及其與迷迭香酸產(chǎn)量的關(guān)系進(jìn)行了初步的探索。具體結(jié)果如下： 1．利用HPLC對(duì)迷迭香酸在不同品種彩葉草(hy1，hy3，hy3，hy4)根、莖、葉中的分布進(jìn)行了檢測(cè)。通過多次實(shí)驗(yàn)得出HPLC檢測(cè)條件如下：柱子：C18柱150x4.6mm：流動(dòng)相：甲醇：0.1％

4、磷酸45：55；流速：0.9mL/分鐘：檢測(cè)波長：325nm。發(fā)現(xiàn)彩葉草不同品種、組織中迷迭香酸含量存在明顯差異，四個(gè)品種中葉片均有較高的迷迭香酸含量，而根、莖組織中迷迭香酸含量較低。我們從四個(gè)彩葉草品種中篩選得到兩個(gè)迷迭香酸含量較高的品種hy1(干重的0.946％)和hy2(干重的1.010％)。 2．在含2％蔗糖的B5培養(yǎng)基中添加不同生長調(diào)節(jié)劑對(duì)hy1和hy2的葉片進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，結(jié)果表明hy2品種的葉片為最適外植體。初步確定

5、最適合愈傷生長和迷迭香酸合成的生長調(diào)節(jié)劑配比為2.0mg/L6-BA，0.5mg/LNAA，0.8mg/L2,4-D，此時(shí)愈傷組織的生長指數(shù)和迷迭香酸的合成量均達(dá)到最大值，分別為49.7和愈傷干重的25.3％。 3．將繼代得到的松散顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同肌醇濃度的上述改良B5液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，最終篩選得到適合細(xì)胞分散的懸浮培養(yǎng)基為添加2.0 mg/L 6-BA，0.5mg/L NAA，0.8mg/L 2,4-D，60

6、0 mg/L肌醇的改良B5液體培養(yǎng)基。 4．用含有不同蔗糖濃度的改良B5培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織和懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)高蔗糖含量對(duì)培養(yǎng)物的生長有明顯抑制作用，但是對(duì)迷迭香酸的合成有顯著的促進(jìn)作用，組織培養(yǎng)物中迷迭香酸在蔗糖含量為6％時(shí)達(dá)到最大生成量，愈傷中迷迭香酸占干重的33.732％，懸浮細(xì)胞中迷迭香酸含量較低，占細(xì)胞干重的10.145％，但此時(shí)愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)物短時(shí)間內(nèi)易褐化死亡。綜合考慮愈傷組織和懸浮細(xì)胞的生長以及迷迭香酸

7、的生物合成，4％的蔗糖濃度為最佳選擇，此時(shí)愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香酸的含量分別占干重的29.839％和6.243％。 5．利用半定量RT-PCR對(duì)：HPPR.基因在彩葉草不同品種和不同組織中的表達(dá)情況與迷迭香酸合成量的關(guān)系進(jìn)行了初步的探索。研究發(fā)現(xiàn)，彩葉草中HPPR基因的表達(dá)水平與迷迭香酸的含量無明顯相關(guān)性。針對(duì)于不同品種的彩葉草，HPPR基因在hy3中的表達(dá)水平高于其它品種，依次為hy3、hy4.、hy1、hy2；而對(duì)于